إعداد و Immunostaining أورجانوتيبيك ميليناتينج شريحة الدماغ الثقافات
Summary
هنا نقدم طريقة لإعداد أورجانوتيبيك الثقافات شريحة من المخيخ الماوس وغمد المايلين تلطيخ من إيمونوهيستوتشيميستري مناسبة للتحقيق في آليات مييلينيشن وريميلينيشن في الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
في الجهاز العصبي، هو المايلين بنية غشاء معقدة التي تم إنشاؤها بواسطة ميليناتينج الدبقية الخلايا، هي محاور عصبية انشياثيس وتسهل التوصيل الكهربي السريع. لقد ثبت تحوير المايلين تحدث في الأمراض العصبية المختلفة، حيث أنها مرتبطة بعجز وظيفي. وهنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للسابقين فيفو النموذجي يتكون من شرائح الدماغ أورجانوتيبيك الماوس، التي يمكن الاحتفاظ بها في الثقافة لعدة أسابيع وكذلك يكون المسمى لتصور المايلين.
Introduction
الخلايا العصبية هي الخلايا عالية الاستقطاب، التي تتكون من حجرة الدهليزي الجذعية التي تتلقى مدخلات من بيئتها، ومحور عصبي يضمن توليد ونشر للنبضات الكهربائية إلى خلايا أخرى. الانتشار السريع، والتسليم في الوقت المناسب للمعلومات أمر أساسي للأداء السليم للجهاز العصبي. في الفقاريات، فإنه يسر مييلينيشن، الذي يتيح زيادة سرعة التوصيل محواري1. المايلين بنية متخصصة التي شكلتها طبقات المضغوطة من غشاء البلازما المتولدة عن إطلاق ميليناتينج، إلا وهي أوليجوديندروسيتيس في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وخلايا شوان في الجهاز العصبي المحيطي (PNS). في كل من الجهاز العصبي المركزي والسندات الإذنية، التفاعلات أكسوجليال محرك تشكيل المجالات محواري المتخصصة: رانفييه للعقد وتلك المحيطة بها المجالات، وبارانوديس، وجوكستابارانوديس2. شرائح محواري المعزولة من المايلين، أو إينتيرنوديس، بديل مع رانفييه للعقد، التي تتوافق مع المجالات أونميليناتيد صغيرة أثرت في القنوات عن طريق بوابة الجهد الصوديوم (Naالخامس). بتركيز عال والتنشيط السريع للقنواتت نا في رانفييه للعقد يسمح تجديد إمكانات العمل، وجنبا إلى جنب مع خصائص العزل من اﻷغماد المايلين، وضمان التوصيل الفعال والسريع سالتاتوري العصب دفعة على طول محور عصبي3.
بالإضافة إلى دورها في التعجيل بسرعة التوصيل دافع العصبية، يوفر إطلاق ميليناتينج الدعم الأيضية لمحور عصبي، الحفاظ على سلامتها طويلة الأجل والمشاركة في4،بقاء5. وعلاوة على ذلك، أصبح من الواضح في السنوات الأخيرة أن المايلين هو التضمين بشكل حيوي في جميع مراحل الحياة، وبالتالي يفترض أن يشارك في التنظيم واللدونه لمختلف وظائف الجهاز العصبي. وهكذا قد تمثل تسويات للتوزيع، وعدد وطول، وسمك اﻷغماد المايلين على طول محاور عصبية طريقة جديدة لضبط دقة مختلف شبكات6،،من78. ولذلك اقتناء التطوري المايلين عملية رئيسية للوظائف الحسية والحركية والمعرفية واضطراب التفاعل بين محاور عصبية وإطلاق يتزايد اعتبار المساهمة الإنمائية أو المكتسبة عصبية 9من الأمراض.
وقد اتسمت تشكيل المايلين، مع ميزة معينة على نسبة عالية من الدهون (70%) مقارنة بالبروتينات (30%) وعلى النقيض من الأغشية الخلوية الأخرى10. ومع ذلك، خلافا للدهون المايلين، معظم البروتينات المايلين محددة إلى المايلين، بما في ذلك البروتين الأساسية المايلين (MBP)، بروتيوليبيد البروتين (حزب العمال التقدمي)، 2 ‘، 3’ دوري النوكليوتيدات 3 ‘-فوسفوديستريس (CNP)، المرتبطة المايلين بروتين سكري (ماج)، بروتين سكري oligodendrocyte المايلين (موج)، بمب-22 و P010. توجد أساليب نسيجية مختلفة وصمة عار المايلين استناداً إلى تكوين الدهن، مثل لوكسول السريع الأزرق11، “السودان الأسود ب”12، بيكر هيماتين حمض أسلوب13، فضلا عن الفضة تلطيخ14. ومع ذلك، هذه النهج لا تسمح دائماً للتباين كافية والقرار لتصور الألياف الفردية. نهج بديل للكشف عن المايلين من خلال إيمونوهيستوتشيميستري الموجهة ضد بروتينات المايلين. مختلف الأجسام المضادة استهداف المستضدات المايلين على حدة مع خصوصية عالية ويمكن استخدامها بشكل روتيني للكشف عن الهياكل ميليناتيد. يمكن كشف تفاعل مستضد الضد كذلك استخدام جسم ثانوية بالإضافة إلى فلوروفوري الموجهة ضد جسم الأولية وتصور مع الفحص المجهري fluorescence كافية. وهنا يصف لنا بروتوكولا عن وصمة عار المايلين على السابقين فيفو شرائح الدماغ، نموذج الذي يسمح المحافظة على حسن هندسة النسيج العصبي. وباﻹضافة إلى ذلك، المنظمة وحجم خلايا بوركنجي (العصبية myelinated الوحيد من المخيخ) جعلها نموذجا كلاسيكي للدراسات الكهربية والمثل مثالية لإجراء دراسات ثابتة أو تصوير العيش.
يتم إنشاء الشرائح الدماغ من الفئران P9 P10، وقت المقابلة إلى بداية مبكرة لخلايا بوركنجي myelination، عملية التي يتحقق معظمها خلال أسبوع واحد السابقين فيفو (6-7 أيام في المختبر، DIV)15. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج تكييف للتحقيق في اضطرابات دملينتينغ مثل التصلب المتعدد (MS)، كما يمكن الناجمين عن demyelination واسعة في الدماغ الشرائح باستخدام مركب ليسوفوسفاتيديلتشوليني ميلينوتوكسيك (أو ليسوليسيثين، LPC)، التي يتبعها16،ريميليناتيون عفوية17. تأخذ مكان من يومين بعد إزالة LPC من المتوسط الثقافة ريميليناتيون الذاتية وهو إكمال علاج بعد أسبوع تقريبا.
الانتهاء من هذا البروتوكول يأخذ أبروكسيماتيفيلي 3 أسابيع، بما في ذلك نصف يوم لإعداد الثقافات شريحة الدماغ وأسبوع للحصول على شرائح myelinated تماما، يليه يومان تصل إلى ذروة demyelination وأسبوع آخر للكاملة ريميليناتيون. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إكمال إيمونوهيستوتشيميستري في 2 يوما. البروتوكول الموصوفة هنا هو يتكيف مع القمامة العادية من 6 الفئران الجراء ويحتاج إلى تكييف فيما يتعلق بعدد الحيوانات التي استخدمت في التجربة المزمعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لإنشاء السابقين فيفو نموذج المقابلة لثقافات شريحة أورجانوتيبيك الدماغ الماوس، تكييفها من قبل أساليب نشر15،،من1619 والمايلين اللاحقة إيمونوستينينج لهذه الاستعدادات. توفر هذه الاستراتيجية إمكانية تصور مكون?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور شون فريمان، والدكتورة ناتالي سول-فولون والدكتور توماس رو لتعليقات قيمة على المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من INSERM، ICM، والمنح أرسيب R13123DD، R17127DD ANR (إلى ميلادي) والعلاجات الزمالة، SPF20110421435 (إلى ميلادي)، FDT20170437332 (لتم). ونشكر مرفق الثقافة الخليوي سيليس و icm. منصة التصوير ضليع في الرياضيات.
Materials
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10X HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60-mm and 100-mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30-mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 x 26 x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture–a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
