Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas

Las neuronas son células altamente polarizadas, que comprenden un compartimiento somato-dendrítica que recibe entradas de su medio ambiente y un axón que garantice la generación y propagación de impulsos eléctricos a otras células. Propagación rápida y oportuna entrega de información es esencial para el buen funcionamiento del sistema nervioso. En los vertebrados, se facilita por la mielinización, que permite aumentar la velocidad de conducción axonal¹. Mielina es una estructura especializada formada por capas compactadas de membrana del plasma generado por la glia myelinating, es decir, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (CNS) y células de Schwann en sistema nervioso periférico (PNS). Tanto en el SNC y el SNP, axoglial interacciones conducen a la formación de dominios especializados de axonales: los nodos de Ranvier y sus alrededores de dominios los paranodes y juxtaparanodes². Los segmentos axonales aislados por mielina o entrenudos, alternas con los nodos de Ranvier, que corresponden a pequeños dominios unmyelinated enriquecidos en canales voltaje-bloqueados del sodio (Na_v). La alta concentración y rápida activación de canales de Na_v en los nodos de Ranvier permiten la regeneración de los potenciales de acción y junto con las propiedades aislantes de las vainas de mielina, garantizar la eficiente y rápida de saltatoria conducción de la transmisión del impulso nervioso a lo largo del axón³.

Además de su papel en la aceleración de la velocidad de conducción del impulso nervioso, glia myelinating proporciona apoyo metabólico para el axón, preservando su integridad a largo plazo y participar en su supervivencia^4,5. Además, ha quedado claro en estos últimos años que esa mielina es modulada dinámicamente a lo largo de la vida, por lo tanto presumiblemente participan en la regulación y plasticidad de diversas funciones del sistema nervioso. Ajustes de la distribución, número, longitud y grosor de las vainas de mielina a lo largo de axones así podrían representar una forma novedosa para ajustar finamente varios redes^6,7,8. Por lo tanto, la adquisición evolutiva de la mielina es un proceso clave para las funciones sensoriales, motores y cognitivos y la alteración de la interacción entre los axones y glia es cada vez más considerada como contribuyendo al desarrollo o adquirida neurológica enfermedades⁹.

Composición de la mielina se ha caracterizado, con la particularidad de una alta proporción de lípidos (70%) en comparación con las proteínas (30%) en contraste con otras¹⁰de las membranas celulares. Sin embargo, a diferencia de los lípidos de la mielina, la mayoría de las proteínas de la mielina es específica de mielina, incluyendo la proteína básica de mielina (MBP), proteína del proteolípido (PLP), 2′, glicoproteína de nucleótidos 3′-cíclico 3′-fosfodiesterasa (CNP), asociada a la mielina (MAG), glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG) y PMP-22, P0¹⁰. Diversos métodos histológicos para tinción de mielina existen en base a su composición de lípidos, como Luxol fast blue¹¹, Sudán negro B¹², de panadero hematina ácida método¹³, así como¹⁴de tinción de plata. Sin embargo, estos enfoques no siempre permiten un adecuado contraste y resolución para visualizar las fibras individuales. Un método alternativo para detectar la mielina es a través de inmunohistoquímica dirigido contra proteínas de mielina. Anticuerpos contra varios antígenos específicos de mielina de destino con una alta especificidad y puede utilizarse rutinariamente para detectar estructuras mielínicas. La interacción antígeno-anticuerpo puede ser revelada aún más usando un anticuerpo secundario unido a un fluoróforo dirigida contra el anticuerpo primario y visualizada con microscopía de fluorescencia adecuada. Aquí, describimos un protocolo inmunoquímico para tinción de mielina en ex vivo cerebelosa rebanadas, un modelo que permite una buena conservación de la arquitectura del tejido nervioso. Además, la organización y el tamaño de las células de Purkinje (la única neurona myelinated del cerebelo) hacen un modelo clásico para los estudios electrofisiológicos y son igualmente ideales para realizar estudios de imágenes en vivo o fijados.

Las láminas cerebelosas se generan a partir de ratones P9-P10, un tiempo correspondiente al inicio temprano de la mielinización de células de Purkinje, un proceso que se logra sobre todo por una semana ex vivo (6-7 días in vitro DIV)¹⁵. Además, este modelo está adaptado para investigar trastornos desmielinizantes como la esclerosis múltiple (EM), como una desmielinización extensa puede ser inducida en rebanadas cerebelosas con el myelinotoxic compuesto lysophosphatidylcholine (o lysolecithin, LPC), que es seguido por una espontánea remyelination^16,17. Remielinización endógena ocurre dos días después del retiro de la LPC del medio de cultivo y es casi completa después del tratamiento una semana.

La realización de este protocolo toma aproximadamente 3 semanas, incluyendo el medio día para la preparación de culturas rebanada cerebelosa, a la semana para obtener rebanadas completamente myelinated, seguidos por 2 días en llegar a la cima del demyelination y otra semana para todo su remielinización. Además, la inmunohistoquímica puede completarse en 2 días. El protocolo descrito aquí se adapta a una estándar camada de 6 cachorros de ratones y necesita ser adaptado con respecto al número de animales utilizados para el experimento planeado.