Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

Neuronen zijn zeer gepolariseerde cellen, die bestaan uit een compartiment somato-dendritische die ingangen ontvangt van haar omgeving en een axon die zorgt voor de generatie en de verspreiding van elektrische impulsen naar andere cellen. Snelle voortplanting en tijdige levering van informatie is essentieel voor de goede werking van het zenuwstelsel. In gewervelde dieren, wordt het door de myelinisering, waardoor verhoging van axonale geleiding snelheid¹vergemakkelijkt. Myeline is een gespecialiseerde structuur gevormd door samengeperste lagen van plasmamembraan gegenereerd door de myelinating-glia, namelijk oligodendrocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) en Schwann cellen in het perifere zenuwstelsel (PNS). Zowel in het centraal zenuwstelsel en de PNS, axoglial interacties rijden de vorming van gespecialiseerde axonale domeinen: de knooppunten van Ranvier en hun omliggende domeinen, de paranodes en juxtaparanodes². De axonale segmenten geïsoleerd door myeline of groeispurt, afgewisseld met de knopen van Ranvier, die overeenkomen met kleine unmyelinated domeinen verrijkt in spanning-gated natrium kanalen (nb_v). De hoge concentratie en het snelle activering van nb_v kanalen op de knooppunten van Ranvier toestaan de regeneratie van de actie potentieel, en samen met de isolerende eigenschappen van de myeline omhulsels, zorgen voor de geleiding van het efficiënte en snelle saltatory van de zenuw impuls langs de axon³.

Naast haar rol bij het versnellen van de snelheid van de geleiding van de zenuw impuls, ondersteunt myelinating glia metabole de axon, behoud van de lange termijn integriteit en deelnemen aan haar overleving^4,5. Bovendien, het is duidelijk geworden in de afgelopen jaren dat die myeline is dynamisch gemoduleerd gedurende het hele leven, dus vermoedelijk deel te nemen aan de verordening en de plasticiteit van de verschillende functies van het zenuwstelsel. Aanpassingen van de distributie, aantal, lengte en dikte van myeline omhulsels langs axonen kunnen dus een nieuwe manier om te fijn afstemmen van verschillende netwerken^6,–^7,8vormen. Dus, de evolutionaire verwerving van myeline is een belangrijke proces voor sensorische, motorische en cognitieve functies en de verstoring van de interactie tussen axonen en glia is steeds meer beschouwd als een bijdrage tot de ontwikkeling of verworven neurologische ziekten⁹.

Myeline samenstelling heeft gekenmerkt, met de specifieke functie van een hoog percentage van lipiden (70%) in vergelijking met eiwitten (30%) in tegenstelling tot andere cellulaire membranen¹⁰. In tegenstelling tot de myeline lipiden zijn meeste van myeline eiwitten echter specifiek voor myeline, met inbegrip van myeline basic protein (MBP), proteolipid eiwit (PLP), 2′, 3′-cyclische nucleotide 3′-fosfodiësterase (NPM), myeline-geassocieerde glycoproteïne (MAG), myeline-Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG), PMP-22 en P0¹⁰. Verschillende histologische methoden om vlek myeline bestaan op basis van de samenstelling van lipide, zoals snel blauwe Luxol¹¹, Soedan zwart B¹², Baker’s zuur hematin methode¹³, evenals zilver¹⁴kleuring. Deze benaderingen doen echter niet altijd mogelijk voor een voldoende contrast en resolutie te visualiseren van individuele vezels. Een alternatieve benadering voor het detecteren van myeline is door middel van immunohistochemistry gericht tegen myeline eiwitten. Verschillende antilichamen richten van de myeline-specifieke antigenen met een hoge specificiteit en kunnen routinematig worden gebruikt voor het detecteren van myelinated structuren. De antilichaam-antigeen interactie kan verder worden onthuld met behulp van een secundair antilichaam gekoppeld aan een fluorophore gericht tegen het primaire antilichaam en gevisualiseerd met voldoende fluorescentie microscopie. Hier beschrijven we een immunochemical protocol om vlekken van myeline op ex vivo cerebellaire segmenten, een model dat voor een goede bewaring van de architectuur van zenuwweefsel zorgt. Bovendien, de organisatie en de grootte van het Purkinje-cellen (de enige myelinated neuron van het cerebellum) laten een klassiek model voor elektrofysiologische studies en ze zijn ook ideaal vast of live-imaging studies te verrichten.

De cerebellaire segmenten worden gegenereerd uit P9-P10 muizen, een tijd die overeenkomt met de vroege begin van Purkinje cel myelinisering, een proces dat meestal door één week ex vivo (6-7 dagen in vitro DIV)^{15 bereikt wordt}. Bovendien, dit model is aangepast aan het onderzoeken van demyeliniserende aandoeningen zoals multiple sclerose (MS), zoals een uitgebreide demyelinisatie kan worden opgewekt in cerebellaire plakjes met behulp van de myelinotoxic-samengestelde lysophosphatidylcholine (of lysolecithin, LPC), die wordt gevolgd door een spontane remyelination^16,17. Endogene remyelination plaatsvindt van twee dagen na de LPC verwijdering uit het kweekmedium en is bijna een week na de behandeling te voltooien.

De voltooiing van dit protocol duurt ongeveer 3 weken, met inbegrip van een halve dag voor cerebellaire segment culturen voorbereiding, een week voor volledig myelinated segmenten, gevolgd door 2 dagen te bereiken van het hoogtepunt van demyelinisatie en nog een week voor hun volledige remyelination. Immunohistochemistry kan bovendien worden uitgevoerd in 2 dagen. Het protocol hier beschreven is aangepast aan een standaard nest van 6 muizen pups en moet worden aangepast met betrekking tot het aantal dieren die worden gebruikt voor de geplande experiment.