Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin
Summary
Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.
Abstract
Sinir sisteminde miyelin gliyal myelinating tarafından oluşturulan bir karmaşık membran yapısı hücreleri, hangi ensheathes akson ve hızlı elektrik iletim kolaylaştırır var. Miyelin değişiklik fonksiyonel açıkları ile ilişkili nerede çeşitli nörolojik hastalıklarda ortaya göstermiştir. Burada, eski bir ayrıntılı bir açıklama sağlamak vivo modeli kültür için birkaç hafta ve daha fazla miyelin görselleştirmek için etiketli muhafaza fare organotypic serebellar dilim, oluşan.
Introduction
Neurons girdileri çevresi ve üretimi ve elektrik darbeleri diğer hücrelere yayılmasını sağlar bir akson alır bir somato-dendritik bölme oluşturan çok polarize hücrelerdir. Hızlı yayılma ve bilgilerin zamanında teslim sinir sisteminin düzgün çalışması için önemlidir. Omurgalılar, aksonal iletim hızı1artan sağlayan myelination tarafından yönetilir. Miyelin sıkıştırılmış katmanları plazma zarı myelinating glia tarafından oluşturulan Merkezi sinir sistemi (MSS), yani oligodendrocytes ve periferik sinir sistemi (PNS) Schwann hücreleri tarafından kurulan özel bir yapıdır. Hem MSS ve PNS, axoglial etkileşimler özel aksonal etki oluşumu sürücü: of Ranvier düğümleri ve onların çevre etki alanları, paranodes ve juxtaparanodes2. Aksonal kesimi miyelin veya internodes, diğer voltaj Kapılı sodyum kanallarının (Nav) zenginleştirilmiş küçük unmyelinated etki alanlarına karşılık gelen düğümü of Ranvier ile izole edilmiş. Yüksek konsantrasyon ve Nav kanal düğümleri of Ranvier adlı hızlı aktivasyon rejenerasyon aksiyon potansiyelleri ve miyelin kılıf yalıtım özellikleri ile birlikte izin, verimli ve hızlı saltatory iletim sağlamak sinir impuls3akson boyunca.
Sinir impuls iletim hızı hızlandırılması rolüne ek olarak, myelinating glia uzun vadeli bütünlüğünü koruyarak ve onun hayatta kalma4,5‘ te katılan axon metabolik destek sağlar. Ayrıca, bu son yıllarda bu miyelin dinamik olarak böylece muhtemelen yönetmelik ve çeşitli sinir sistemi fonksiyonları plastisite katılan hayatı boyunca modülasyonlu anlaşılır bir hizmet haline gelmiştir. Dağıtım, sayısını, uzunluğu ve akson boyunca miyelin kılıf kalınlığını ayarlar böylece ince çeşitli ağlar6,7,8ayarlamak için yeni bir yol gösterebilir. Bu nedenle, miyelin evrimsel edinimi duyusal, motor ve Bilişsel işlevler için anahtar bir süreçtir ve akson ve glia arasındaki etkileşimi pertürbasyon giderek gelişimsel için katkı olarak kabul veya nörolojik elde hastalıklar9.
Miyelin kompozisyon, lipitler (% 70) yüksek oranda belirli özelliği ile karakterize proteinler (% 30) ile karşılaştırıldığında diğer hücresel zarları10aksine. Ancak, miyelin lipidler, miyelin proteinler miyelin temel protein (MBP), proteolipid protein (PIP), 2′, 3′-döngüsel nükleotit 3′-miyelin ilişkili fosfodiesteraz (CNP), glikoprotein (MAG), dahil olmak üzere miyelin için belirli çoğu miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG), PMP-22 ve P010. Miyelin leke çeşitli histolojik yöntemlerle temel alınarak Luxol hızlı mavi11gibi onun lipit bileşimi, Sudan Siyah B12, Baker’ın asit hematin yöntemi13yanı sıra14boyama gümüş adlı biri yok. Yine de, bu yaklaşımlar her zaman bir yeterli kontrast ve bireysel lifleri görselleştirmek için çözünürlük için izin vermez. Miyelin algılamak için alternatif bir yaklaşım miyelin proteinler karşı yönetmen immünhistokimya geçer. Çeşitli antikor miyelin özgü antijenlere yüksek özgüllük ile hedef ve düzenli olarak myelinated yapıları algılamak için kullanılabilir. Antikor-antijen etkileşim daha da bir fluorophore karşı birincil antikor yönettiği ve yeterli Floresans mikroskobu ile görüntülenmeyecektir için ikincil bir antikor kullanarak birleştiğinde ile açığa çıkarılabilir. Burada, immunochemical bir protokol üzerinde miyelin ex vivo serebellar dilimleri, sinir dokusu mimari iyi korunması için izin veren bir model leke açıklayın. Buna ek olarak, organizasyon ve boyutu Purkinje hücre (beyincik tek myelinated nöron) onlara Elektrofizyolojik çalışmalar için klasik bir model ve benzer şekilde sabit veya canlı görüntüleme çalışmaları gerçekleştirmek idealdir.
Serebellar dilimleri P9-P10 fareler Purkinje hücre myelination, çoğunlukla bir hafta ex vivo (6-7 gün in vitro DIV)15elde edilir bir süreç erken başlangıçlı karşılık gelen bir kez oluşturulur. Ayrıca, bu modeli geniş bir demiyelinizasyon myelinotoxic bileşik lysophosphatidylcholine (veya lysolecithin, LPC) kullanarak serebellar dilimler halinde indüklenen gibi multipl skleroz (MS), gibi demiyelinizan hastalıkları araştırmak için adapte hangi bir spontan remyelination16,17tarafından takip edilir. Endojen remyelination iki gün kültür ortamdan LPC çıkarıldıktan sonra gerçekleşir ve neredeyse bir hafta sonrası tedavi tamamlamak olduğunu.
Approximatively 3 hafta serebellar dilim kültürler hazırlık, tam myelinated dilimleri, demiyelinizasyon ulaşmak için 2 gün tarafından takip elde etmek için bir hafta ve onların tam bir hafta için yarım gün de dahil olmak üzere, bu protokolün tamamlanmasından alır remyelination. Buna ek olarak, immünhistokimya 2 gün içinde tamamlanabilir. Burada açıklanan protokol 6 fare pups standart bir çöp için uyarlanmış ve planlı deneme için kullanılan hayvan sayısı ile ilgili adapte gerekiyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, eski bir oluşturmak için bir protokol ayrıntılı fare serebellar organotypic dilim kültürler için karşılık gelen vivo modeli adapte üzerinden daha önce yayımlanmış yöntemleri15,16,19 ve sonraki miyelin Bu hazırlıklar immunostaining. Bu strateji ile bir yüksek çözünürlüklü miyelin bileşenlerinde sağlıklı ve patolojik durumları görselleştirmek için imkanı sunuyor.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr Sean Freeman, Dr Nathalie Sol-Foulon ve Dr Thomas Roux el yazması üzerine değerli yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser INSERM, ICM, ARSEP hibe R13123DD, ANR R17127DD (MS için) ve FRM dostluk, SPF20110421435 (için ad), tarafından finanse edildi (M.T. için) FDT20170437332. Biz CELIS hücre kültür tesis ve ICM teşekkür ederim. Quant görüntüleme platformu.
Materials
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10X HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60-mm and 100-mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30-mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 x 26 x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture–a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
