Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה
Summary
כאן אנו מציגים שיטה להכין organotypic פרוסה תרבויות מן המוח הקטן העכבר מיאלין, צביעת על-ידי אימונוהיסטוכימיה מתאים לחקור מנגנונים של myelination ו- remyelination במערכת העצבים המרכזית.
Abstract
המיאלין במערכת העצבים, הוא מבנה הממברנה מורכבות שנוצרו על-ידי myelinating גליה תאים, אשר אקסונים ensheathes ומקל מהר וההולכה. שינוי המיאלין הוכח להופיע במחלות נוירולוגיות שונות, איפה היא מזוהה עם גירעונות פונקציונלי. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של אקסית vivo דגם המורכב העכבר organotypic אסטרוציטומה פרוסות, אשר יכול להישמר בתרבות במשך מספר שבועות, עוד יותר להיקרא להמחיש מיאלין.
Introduction
הנוירונים הם תאים מאוד מקוטב, המהווים תא somato-דנדריטים שמקבל קלט מן הסביבה של האקסון המבטיחה את יצירתם והובלתם של דחפים חשמליים לתאים אחרים. התפשטות מהירה ומדויקת של מידע חיוני לתפקוד תקין של מערכת העצבים. גולגולת, זה בהנחייתם של myelination, אשר מאפשר הגדלת מהירות הולכה עצב1. המיאלין הוא מבנה מיוחדים הנוצרת על-ידי שכבות הדחוס של קרום פלזמה שנוצר על ידי myelinating עכשיו, דונלד, כלומר oligodendrocytes להפוך במערכת העצבים המרכזית (CNS) ותאי שוואן במערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית). גם מערכת העצבים וגם את מערכת העצבים ההיקפית, axoglial אינטראקציות לנהוג היווצרות של תחומים עצב מיוחדים: את Ranvier של צמתי ו שלהם שמסביב תחומים, paranodes ו juxtaparanodes2. הקטעים עצב מבודדים על ידי המיאלין, או פרקי הגבעולים, לסירוגין עם Ranvier של צמתים, המקבילים לתחומים unmyelinated קטן מועשר בערוצים ממותגת מתח נתרן (Nav). ריכוז גבוה של הפעלה מהירה של ערוציv נה Ranvier של צמתי לאפשר לרגנרציה של פוטנציאל פעולה, ויחד עם המאפיינים בידוד של עטיפות המיאלין, להבטיח את הולכה saltatory מהיר ויעיל של הדחף העצבי לאורך האקסון3.
בנוסף לתפקידה ב מאיצה את מהירות הולכה של הדחף העצבי, עכשיו, דונלד myelinating מספק תמיכה מטבולית הדנדריטי לאקסון, שמירה על שלמותה לטווח ארוך והשתתפות שלה4,של הישרדות5. יתר על כן, כבר ברור בבשנים האחרונות שהמיאלין הזה הוא מווסת באופן דינמי לאורך החיים, ולכן יש להניח המשתתפים תקנה הפלסטיות של פונקציות שונות של מערכת העצבים. התאמות של ההתפלגות, מספר, האורך, עובי של עטיפות המיאלין לאורך אקסונים ובכך עשוי לייצג דרך מקורית לכוון דק שונים רשתות6,7,8. לכן, רכישת המיאלין האבולוציוני הוא תהליך מפתח עבור פונקציות חושית, מוטורי, קוגניטיבי, ההפרעות של אינטראקציה בין אקסונים עכשיו, דונלד יותר ויותר נחשב לתרום התפתחותי או רכשה נוירולוגיות מחלות9.
קומפוזיציה מיאלין מלווה, עם תכונה ספציפית של שיעור גבוה של שומנים (70%) בהשוואה חלבונים (30%) בניגוד ממברנות הסלולר10. עם זאת, בניגוד המיאלין שומנים, רוב החלבונים המיאלין הן ספציפיות המיאלין, כולל חלבון המיאלין הבסיסי (MBP), חלבון proteolipid (פיפ), 2′, נוקלאוטיד 3′-מחזורית 3′-phosphodiesterase (CNP), הקשורים המיאלין גליקופרוטאין (מג), מיאלין-אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א), PMP-22, P010. שיטות שונות היסטולוגית כתם המיאלין קיים המבוסס על הרכב השומנים שלה, כגון Luxol מהר כחול11, סודאן שחור B12, של בייקר חומצה ותקיזו את דמה שיטת13, וכן כסף מכתים14. למרות זאת, גישות אלה אינם תמיד מאפשרים עבור ניגודיות הולמת וגם רזולוציה להמחיש סיבים בודדים. גישה חלופית לזהות המיאלין היא דרך אימונוהיסטוכימיה נגד חלבונים מיאלין. נוגדנים שונים יעד ספציפי המיאלין אנטיגנים עם ירידה לפרטים גבוה והוא יכול לשמש באופן שגרתי כדי לזהות מבנים סיבי העצב. האינטראקציה נוגדן-אנטיגן אשר ניתן עוד יותר לגילוי באמצעות נוגדנים משניים מצמידים fluorophore נגד נוגדן ראשוני, דמיינו פלורסצנטיות נאותה מיקרוסקופ. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול immunochemical כתם מיאלין ב- ex-vivo אסטרוציטומה פרוסות, מודל המאפשר לשימור טוב הארכיטקטורה רקמות עצבים. בנוסף, הארגון ואת גודל של תאי Purkinje (הנוירון סיבי העצב הבלעדית של הצרבלום) לגרום להם מודל קלאסי ללימודי אלקטרופיזיולוגיות, הם אידיאליים באופן דומה לביצוע מחקרים קבוע או הדמיה לחיות.
הפרוסות אסטרוציטומה נוצרים מן P9-P10 עכברים, זמן המתאים תחילת מוקדם Purkinje תא myelination, תהליך זה מושגת בעיקר בשבוע אחד ex-vivo (6-7 ימים במבחנה, DIV)15. יתר על כן, המודל הזה הוא מותאם כדי לחקור את המיאלין הפרעות כגון טרשת נפוצה (MS), כפי demyelination נרחבת יכולה להיגרם אסטרוציטומה פרוסות באמצעות myelinotoxic המורכב lysophosphatidylcholine (או lysolecithin, LPC), אשר ואחריו16,remyelination ספונטנית17. Remyelination אנדוגני מתקיים בין יומיים לאחר הסרת LPC של המדיום תרבות והוא כמעט מוחלט של שבוע לאחר הטיפול.
השלמתו של פרוטוקול זה לוקח 3 שבועות שנהנתם, כולל חצי יום הכנה תרבויות פרוסה אסטרוציטומה, שבוע כדי לקבל פרוסות מלא סיבי העצב, ואחריו 2 ימים כדי להגיע לשיא של demyelination, עוד שבוע עבור שלהם מלא remyelination. בנוסף, ניתן להשלים אימונוהיסטוכימיה 2 ימים. הפרוטוקול המתואר כאן מותאם בהמלטה סטנדרטי של 6 הגורים עכברים וצריך להתאים בנוגע למספר בעלי החיים שבהם משתמשים עבור הניסוי המתוכנן.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנחנו פירוט פרוטוקול ליצירת אקסית vivo מודל המתאים התרבויות פרוסה organotypic אסטרוציטומה העכבר, המותאם ממשחק בעבר שיטות שפורסמו15,16,19 ו את המיאלין עוקבות immunostaining של ההכנות הללו. אסטרטגיה זו מציעה את האפשרות לדמיין המיאלין רכיבים עם ברזולוצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר שון פרימן, ד ר נטלי סול-Foulon, ד ר תומס רו להערות יקר על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי INSERM, ICM, מענקים ARSEP R13123DD, R17127DD ANR (כדי לספירה) ואחווה עקרות, SPF20110421435 (כדי לספירה) FDT20170437332 (ל. מ. ת). אנו מודים המתקן תרבות תא CELIS, את icm. פלטפורמת הדמיה חשבים.
Materials
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10X HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60-mm and 100-mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30-mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 x 26 x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture–a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
