Preparazione e Immunostaining di su colture organotipiche Myelinating fetta cerebellare

I neuroni sono cellule altamente polarizzate, che comprendono un vano somato-dendritica che riceve gli input dal suo ambiente e un assone che assicura la generazione e la propagazione di impulsi elettrici ad altre cellule. Propagazione rapida e tempestiva consegna delle informazioni è essenziale per il corretto funzionamento del sistema nervoso. Nei vertebrati, esso è facilitato dalla mielinizzazione, che permette di aumentare la velocità di conduzione assonale¹. Mielina è una struttura specializzata formata da strati compattati della membrana di plasma generato dalla glia myelinating, vale a dire gli oligodendrociti nel sistema nervoso centrale (SNC) e cellule di Schwann nel sistema nervoso periferico (PNS). Sia nel SNC e SNP, interazioni axoglial guidare la formazione di domini axonal specializzati: i nodi di Ranvier e loro circostante di domini, paranodes e juxtaparanodes². I axonal segmenti isolati di mielina o internodi, si alternano con i nodi di Ranvier, che corrispondono a piccoli domini unmyelinated arricchiti in scanalature tensione-gated del sodio (Na_v). L’alta concentrazione e la rapida attivazione di canali_v Na presso i nodi di Ranvier consentono la rigenerazione dei potenziali d’azione e insieme con le proprietà isolanti delle guaine mieliniche, garantire la conduzione efficiente e veloce stile della impulso nervoso lungo l’ assone³.

Oltre al suo ruolo nell’accelerare la velocità di conduzione dell’impulso nervoso, glia myelinating fornisce supporto metabolico per l’assone, preservare la sua integrità a lungo termine e che partecipano della sua sopravvivenza^4,5. Inoltre, è diventato chiaro in anni recenti che mielina è modulata in modo dinamico per tutta la vita, quindi presumibilmente partecipano il regolamento e la plasticità delle varie funzioni del sistema nervoso. Rettifiche nette per la distribuzione, numero, lunghezza e spessore delle guaine di mielina lungo gli assoni così potrebbero rappresentare un nuovo modo di regolare vari reti^6,7,8. Pertanto, l’acquisizione evolutiva della mielina è un processo chiave per le funzioni sensoriali, motorie e cognitive e la perturbazione dell’interazione tra assoni e cellule gliali è sempre più considerata come un contributo per l’inerente allo sviluppo o acquisite neurologica malattie⁹.

Composizione della mielina è stata caratterizzata, con la caratteristica peculiare di un’alta percentuale di lipidi (70%) rispetto alle proteine (30%) a differenza di altre membrane cellulari¹⁰. Tuttavia, a differenza dei lipidi della mielina, la maggior parte delle proteine della mielina sono specifica di mielina, tra cui la proteina basica della mielina (MBP), proteolipide (PLP), 2′, glicoproteina di 3′-ciclico del nucleotide 3′-fosfodiesterasi (CNP), mielina (MAG), glicoproteina del oligodendrocyte del myelin (MOG), PMP-22 e P0¹⁰. Vari metodi istologici a macchiare la mielina esistano base alla sua composizione lipidica, come Luxol fast blu¹¹, Sudan nero B¹², Baker ematina acida metodo¹³, così come¹⁴di macchiatura d’argento. Tuttavia, questi approcci non sempre consentono un adeguato contrasto e risoluzione per visualizzare le singole fibre. Un approccio alternativo per rilevare la mielina è tramite immunoistochimica diretto contro proteine della mielina. Vari anticorpi antigeni della mielina-specifici di destinazione con un’alta specificità e possono essere utilizzati regolarmente per rilevare strutture myelinated. L’interazione antigene-anticorpo può essere ulteriormente rivelato utilizzando un anticorpo secondario accoppiato ad un fluoroforo diretto contro l’anticorpo primario e visualizzati con microscopia di fluorescenza adeguata. Qui, descriviamo un protocollo immunochimico per macchiare la mielina su ex vivo cerebellare fette, un modello che permette per una buona conservazione dell’architettura del tessuto nervoso. Inoltre, l’organizzazione e la dimensione delle cellule del Purkinje (l’unico neurone myelinated del cervelletto) li rendono un modello classico per gli studi elettrofisiologici e sono allo stesso modo ideale per svolgere gli studi fissi o live-imaging.

Le fette cerebellare sono generate dai topi P9-P10, un tempo corrispondente alla comparsa precoce di mielinizzazione delle cellule di Purkinje, un processo che avviene per lo più di una settimana ex vivo (6-7 giorni in vitro, DIV)¹⁵. Inoltre, questo modello è adattato per indagare demielinizzanti come la sclerosi multipla (SM), come un vasto demyelination può essere indotta a cerebellare fette utilizzando myelinotoxic composto lisofosfatidilcolina (o lisolecitina, LPC), cui è seguita da una spontanea remyelination^16,17. Remyelination endogeno avviene da due giorni dopo la rimozione di LPC dal terreno di coltura ed è quasi completa un post trattamento di settimana.

Il completamento del presente protocollo prende circa 3 settimane, tra cui una mezza giornata per la preparazione di colture cerebellare fetta una settimana per ottenere fette completamente myelinated, seguite da 2 giorni per raggiungere la vetta del demyelination e un’altra settimana per loro pieno remyelination. Inoltre, immunohistochemistry può essere completato in 2 giorni. Il protocollo descritto qui è adattato a una cucciolata standard di 6 topi cuccioli e deve essere adattato per quanto riguarda il numero di animali utilizzati per l’esperimento pianificato.