Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

Neuronen sind stark polarisierten Zellen, die eine Somato-dendritische Fach umfassen, die erhält Eingänge von seiner Umgebung und ein Axon, das die Erzeugung und Ausbreitung der elektrischen Impulse an andere Zellen sicherstellt. Schnelle Ausbreitung und rechtzeitige Bereitstellung von Informationen ist entscheidend für das reibungslose Funktionieren des Nervensystems. Bei Wirbeltieren wird es durch Myelinisierung, erleichtert, ermöglicht die Erhöhung der axonalen Wärmeleitung Geschwindigkeit¹. Myelin ist eine spezielle Struktur, die durch verdichtete Schichten der Plasmamembran durch die Myelinating Glia erzeugt nämlich Oligodendrozyten in das zentrale Nervensystem (ZNS) und Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem (PNS) gebildet. Sowohl in das ZNS und PNS, Axoglial Interaktionen fahren die Bildung von spezialisierten axonalen Domänen: die Knoten von Ranvier und ihre umliegenden Domänen, Paranodes und Juxtaparanodes². Die axonalen Segmente isoliert von Myelin oder Internodien, wechseln sich ab mit den Knoten von Ranvier, die kleine unmyelinierten Domänen bereichert in Voltage-gated Natriumkanäle (Na_V) entsprechen. Die hohe Konzentration und schnelle Aktivierung der Na_V Kanäle auf den Knoten von Ranvier ermöglichen die Regeneration von Aktionspotentialen und zusammen mit den isolierenden Eigenschaften der Myelinscheiden, gewährleisten die effiziente und schnelle saltatory Wärmeleitung von der Nervenleitung längs des Axon-³.

Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Beschleunigung die Leitgeschwindigkeit der Nervenleitung unterstützt Myelinating Glia metabolische das Axon, die langfristige Integrität bewahren und die Teilnahme an den überleben-^4,–⁵. Darüber hinaus ist deutlich in den letzten Jahren geworden, dass das Myelin dynamisch lebenslang damit vermutlich die Teilnahme bei der Regulierung und Plastizität der verschiedenen Funktionen des Nervensystems moduliert wird. Anpassungen der Verteilung, Anzahl, Länge und Dicke der Myelinscheiden entlang der Axone können somit einen neuartigen Weg, um verschiedene Netze^6,7,8fein tunen darstellen. Daher die evolutionäre Übernahme von Myelin ist ein Schlüsselprozess bei sensorischen, motorischen und kognitiven Funktionen und die Störung der Interaktion zwischen Axone und Gliazellen ist zunehmend als Beitrag zu den Entwicklungsstörungen oder erworbenen neurologischen Krankheiten-⁹.

Myelin Zusammensetzung hat geprägt, mit der Besonderheit eines hohen Anteils von Lipiden (70 %) im Vergleich zu Proteine (30 %) im Gegensatz zu anderen zellularen Membranen¹⁰. Allerdings sind die meisten der Myelin Proteine im Gegensatz zu Myelin Lipide spezifisch für Myelin, einschließlich Myelin basic Protein (MBP), Proteolipid-Protein (PLP), 2′, 3′-cyclic Nucleotide 3′-Phosphodiesterase (CNP), Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG), Myelin-Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG), PMP-22 und P0¹⁰. Verschiedenen histologische Methoden Myelin Fleck gibt es anhand seiner Lipidzusammensetzung wie Luxol schnell blau¹¹, Sudan schwarz B¹², Bakers Säure Hematin Methode¹³, sowie Silber Färbung¹⁴. Dennoch lassen diese Ansätze nicht immer für einen ausreichenden Kontrast und Auflösung, Einzelfasern zu visualisieren. Ein alternativer Ansatz zur Erkennung von Myelin ist durch Immunhistochemie gegen Myelin Proteine gerichtet. Verschiedene Antikörper gezielt Myelin-spezifische Antigene mit hoher Spezifität und können routinemäßig verwendet werden, um Markhaltige Strukturen zu erkennen. Die Antikörper-Antigen-Interaktion kann weiter aufgedeckt werden, dass mit einem sekundären Antikörper gekoppelt an ein Fluorophor gegen den Primärantikörper gerichtet und mit angemessenen Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Hier beschreiben wir eine immunchemische Protokoll um Myelin auf ex Vivo zerebelläre Scheiben, ein Modell zu beflecken, ermöglicht eine gute Erhaltung der Architektur des Nervengewebes. Darüber hinaus die Organisation und die Größe von den Purkinje-Zellen (die einzige Markhaltige Neuronen des Kleinhirns) machen sie ein klassisches Modell für elektrophysiologische Untersuchungen und sie sind ebenso ideal, feste oder live-Imaging-Untersuchungen durchzuführen.

Die zerebelläre Scheiben entstehen von P9 P10 Mäusen, eine Zeit entspricht dem frühen Beginn der Purkinje Zelle Myelinisierung, ein Prozess, der vor allem durch eine Woche ex Vivo (ca. 6-7 Tage in-vitro-DIV)¹⁵erreicht wird. Darüber hinaus ist dieses Modell angepasst, demyelinisierende Erkrankungen wie der multiplen Sklerose (MS), zu untersuchen, wie eine umfangreiche Demyelinisierung im Kleinhirn Scheiben mit der Myelinotoxic Verbindung Lysophosphatidylcholine (oder Lysolecithin, LPC), induziert werden kann dem folgt eine spontane Remyelinisierung^16,17. Endogene Remyelinisierung findet statt von zwei Tagen nach der LPC-Entfernung aus dem Kulturmedium und ist fast eine Woche nach der Behandlung vollständig.

Die Vollendung dieses Protokolls dauert ca. 3 Wochen, einschließlich einen halben Tag lang zerebelläre Slice Kulturen Vorbereitung, eine Woche völlig Markhaltige Scheiben, gefolgt von 2 Tagen auf dem Gipfel der Demyelinisierung zu erhalten und eine weitere Woche für ihre volle Remyelinisierung. Darüber hinaus kann Immunohistochemistry in 2 Tagen abgeschlossen sein. Das hier beschriebene Protokoll ist ein standard Wurf von 6 Mäusen Welpen angepasst und hinsichtlich der Anzahl der für das geplante Experiment verwendeten Tiere angepasst werden muss.