Préparation et Immunostaining des cérébelleux Myélinisantes Organotypiques

Les neurones sont des cellules hautement polarisées, qui forment un compartiment somato-dendritique qui reçoit les entrées de son environnement et un axone qui assure la génération et la propagation des impulsions électriques à d’autres cellules. Propagation rapide et en temps opportun de l’information est essentielle au bon fonctionnement du système nerveux. Chez les vertébrés, elle est facilitée par la myélinisation, qui permet d’augmenter la vitesse de conduction axonale¹. La myéline est une structure spécialisée, formée par des couches compactées de membrane de plasma généré par les cellules gliales myélinisantes, à savoir les oligodendrocytes dans le système nerveux central (CNS) et les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique (PNS). Aussi bien dans le SNC et des billets à ordre, des interactions axoglial conduire la formation de domaines axonales spécialisés : les nœuds de Ranvier et leurs domaines, paranodes et juxtaparanodes environs². Les segments axones isolés par la myéline ou entrenoeuds, alternent avec les nœuds de Ranvier, qui correspondent aux petits domaines amyélinisés enrichis dans les canaux sodiques voltage-dépendants (Na_v). La forte concentration et l’activation rapide des canaux_v Na aux nœuds de Ranvier permettent la régénération des potentiels d’action et ainsi que les propriétés isolantes de la gaine de myéline, assurer la conduction saltatoire rapide et efficace de la influx nerveux le long de l’ axone³.

Outre son rôle dans l’accélération de la vitesse de conduction de l’influx nerveux, cellules gliales myélinisantes fournit soutien métabolique à l’axone, la préservation de son intégrité à long terme et de participer à sa survie,^4,à⁵. En outre, il est devenu évident dans ces dernières années que la myéline est modulée dynamiquement tout au long de la vie, sans doute participant ainsi à la régulation et la plasticité des diverses fonctions du système nerveux. Réglages de la distribution, nombre, longueur et épaisseur des gaines de myéline le long des axones peuvent ainsi représenter une nouvelle manière de régler finement les différents réseaux^6,7,8. Par conséquent, l’acquisition évolutive de la myéline est un processus essentiel pour les fonctions sensorielles, motrices et cognitives et la perturbation de l’interaction entre les axones et cellules gliales est plus en plus considérée comme faisant partie de développement ou acquises neurologique les maladies⁹.

Composition de la myéline a été caractérisée, avec la particularité d’une grande proportion de lipides (70 %) par rapport aux protéines (30 %) Contrairement à d’autres membranes cellulaires¹⁰. Cependant, contrairement aux lipides de la myéline, la plupart des protéines de la myéline sont spécifique à la myéline, dont la protéine basique de la myéline (MBP), protéine protéolipidique (PLP), 2′, glycoprotéine de 3′-nucléotide cyclique 3′-phosphodiestérase (CNP), associée à la myéline (MAG), glycoprotéine myéline oligodendrocyte (MOG), PMP-22 et P0¹⁰. Diverses méthodes histologiques sur la tache de la myéline existent selon sa composition lipidique, tel que Luxol rapide bleu¹¹, Soudan noir B¹², Baker hématine acide méthode¹³, ainsi que¹⁴de coloration à l’argent. Néanmoins, ces approches ne permettent pas toujours un contraste adéquat et la résolution pour visualiser des fibres individuelles. Une autre approche pour détecter la myéline est par immunohistochimie dirigé contre les protéines de la myéline. Différents anticorps ciblent les antigènes spécifiques de la myéline avec une grande spécificité et peuvent être utilisés régulièrement pour détecter les structures myélinisées. L’interaction d’anticorps-antigène peut être révélée davantage à l’aide d’un anticorps secondaire couplé à un fluorophore dirigées contre l’anticorps primaire et visualisé à l’aide de la microscopie en fluorescence adéquate. Nous décrivons ici un protocole immunochimique pour souiller la myéline sur ex vivo tranches de cervelet, un modèle qui permet une bonne conservation de l’architecture du tissu nerveux. En outre, l’organisation et la taille des cellules de Purkinje (le seul neurone myélinisée du cervelet) rendent un modèle classique pour des études électrophysiologiques et ils sont de même idéales pour réaliser des études fixes ou d’images en direct.

Les tranches de cervelet sont générés à partir de souris P9-P10, un temps correspondant à l’apparition précoce de cellules de Purkinje myélinisation, un processus qui est principalement réalisé en une semaine ex vivo (6-7 jours in vitro, DIV)¹⁵. En outre, ce modèle est adapté pour enquêter sur les troubles démyélinisantes chronique comme la sclérose en plaques (MS), car une démyélinisation étendue peut être induite en tranches de cervelet à l’aide de la lysophosphatidylcholine composée de myelinotoxic (ou lysolécithine, LPC), qui est suivie par une remyélinisation spontanée^16,17. Remyélinisation endogène a lieu deux jours après l’enlèvement de la LPC milieu de culture et est presque complète un traitement de post de la semaine.

L’achèvement du présent protocole prend environ 3 semaines, dont une demi-journée pour la préparation de cultures de tranches cérébelleux, une semaine pour obtenir des tranches entièrement myélinisées, suivis de 2 jours pour atteindre le sommet de démyélinisation et une autre semaine pour leur plein remyélinisation. En outre, l’immunohistochimie peut être complété en 2 jours. Le protocole décrit ici est adapté à une portée standard de 6 chiots de souris et doit être adaptée au sujet du nombre d’animaux utilisés pour l’expérience prévue.