Подготовка и иммуноокрашивания Myelinating Organotypic мозжечка ломтик культур

Нейроны являются крайне поляризованную клетки, которые составляют Сомато дендритных отсек, который получает входы от окружающей его среды и аксон, который обеспечивает генерации и распространения электрических импульсов в другие ячейки. Быстрое распространение и своевременное предоставление информации имеет важное значение для правильного функционирования нервной системы. В позвоночных он способствует миелинизации, что позволяет увеличить аксональное проводимости скорости¹. Миелиновые является специализированная структура, образованная уплотненных слоев плазматической мембраны, порожденных myelinating глии, а именно Олигодендроциты в центральной нервной системе (ЦНС) и Шванновские клетки в периферической нервной системы (ПНС). Как в ЦНС и ПНС, axoglial взаимодействия диск формирование специализированных аксональное доменов: Ranvier из узлов и их окружающие доменов, paranodes и juxtaparanodes². Аксональное сегменты, изолированные миелина, или междоузлий, чередуются с Ranvier на узлы, которые соответствуют малых unmyelinated домены, обогащенный в закрытом напряжения натриевых каналов (Na_v). Высокая концентрация и быстрой активации Na_v каналов на узлы по Ranvier позволяют регенерации потенциалы действия и вместе с теплоизоляционные свойства миелиновой оболочки, обеспечить проведение эффективных и быстро saltatory нервного импульса вдоль аксона³.

В дополнение к своей роли в ускорении скорости проведения нервного импульса глии myelinating обеспечивает метаболические поддержку Аксон, сохраняя его долгосрочной целостности и участвуя в ее выживание^4,5. Кроме того это стало ясно в последние годы, что миелина динамически модулируется на протяжении всей жизни, таким образом, предположительно участвующих в регулирование и пластичности различных функций нервной системы. Корректировки распределения, номер, Длина и толщина миелиновой оболочки вдоль аксоны может таким образом представляют новый способ тонко настраивать различные сети^6,,7–⁸. Таким образом эволюционное приобретение миелина является ключевой процесс для чувств, мотор и когнитивных функций и возмущений взаимодействия между аксонов и глии все чаще рассматривается как вклад развития или приобретенные неврологические болезни⁹.

Характеризуется состав миелина, с конкретной функцией значительная липидов (70%) по сравнению с белками (30%) в отличие от других клеточных мембран¹⁰. Однако в отличие от миелина липиды, большинство белки миелина специфичные для миелина, включая основной белок миелина (MBP), proteolipid белка (ПЛП), 2′, 3′-циклических нуклеотидов 3′-фосфодиэстеразы (CNP), связанные миелина гликопротеина (МАГ), миелин Олигодендроциты гликопротеина (мог), PMP-22 и¹⁰P0. Основе его состав липидов, например Luxol быстро синий¹¹, Судан черный B¹², Бейкер кислоты hematin метод¹³, а также Серебряный пятнать¹⁴существуют различные гистологической методы пятно миелина. Тем не менее эти подходы не всегда позволяют для адекватного контрастность и разрешение для визуализации отдельных волокон. Альтернативный подход для выявления миелина является иммуногистохимия, направленных против белки миелина. Различные антитела целевых миелина специфичные антигены с высокой точностью и может быть использован регулярно для обнаружения Миелинизированные структур. Взаимодействие антител антигена можно далее показал, что с помощью вторичных антител в сочетании с Флюорофор направленных против основного антитела и визуализированы с адекватной флуоресцентной микроскопии. Здесь мы описываем иммунохимических протокол пятно миелина на ex vivo мозжечковой ломтиками, модель, которая позволяет для хорошего сохранения архитектуры нервной ткани. Кроме того Организации и размер клеток Пуркинье (единственным Миелинизированные нейронов мозжечка) делают их классическая модель для электрофизиологических исследований и аналогичным образом они идеальны для выполнения исследований фиксированной или жить изображений.

Мозжечковая фрагменты создаются из P9-P10 мышей, время, соответствующее раннее начало клеток Пуркинье миелинизации, процесс, который достигается в основном на одну неделю ex vivo (6-7 дней в пробирке, DIV)¹⁵. Кроме того эта модель адаптирована к расследованию демиелинизирующих расстройств, таких как рассеянный склероз (РС), как обширные демиелинизации может быть наведено в мозжечковой ломтики с использованием комплекса lysophosphatidylcholine myelinotoxic (или lysolecithin, LPC), который сопровождается спонтанное remyelination^16,17. Эндогенные remyelination происходит от двух дней после удаления ЛСМ из питательной среды и является почти полной недели после лечения.

Завершение этого протокола занимает около 3 недель, в том числе полдня для подготовки мозжечковой ломтик культур, в неделю, чтобы получить полностью Миелинизированные ломтиками, после 2 дней, чтобы достичь пика демиелинизации и еще одна неделя для их полного remyelination. Кроме того иммуногистохимия может быть завершена в течение 2 дней. Протокол, описанные здесь адаптирована к стандартной помет мышей 6 детенышей и необходимо адаптировать относительно количество животных, используемых для запланированного эксперимента.