이 프로토콜 이미징 나노 해상도 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 조직에서 특정 셀을 대상. 가벼운 현미경 목표를 식별 하 고는 SEM.에서 계층적 방식으로 다 수 생물학 물자 수 지 포함에서 직렬 섹션의 처음 몇 군데
혼합된 셀 인구 또는 조직 내에서 ultrastructural 해상도에서 특정 셀을 대상으로 하는 것은 계층적 이미징 빛과 전자 현미경의 조합을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 수 지에 포함 된 샘플 배열 ultrathin 섹션의 수백의 리본 메뉴의 구성으로 구분 되며, 실리콘 웨이퍼 또는 導 코팅된 coverslips의 조각에. 어레이 낮은 해상도 fluorophores 후 스마트폰 카메라 또는 급속 한 큰 지역 개요에 대 한 가벼운 현미경 (LM) 또는 넓은 분야 형광 현미경 (형광 가벼운 현미경 검사 법 (FLM)) 같은 디지털 소비자를 사용 하 여 몇 군데. 중 금속으로 얼룩 후, 후 배열 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 몇 군데는. 대상 선택 FLM에 의해 생성 된 3 차원 복원 또는 아무 형광 마커를 사용할 수 있는 경우 중간 해상도 SEM 이미지 스택에서 만든 3D 개조에서 가능 하다. Ultrastructural 분석에 대 한 선택된 대상 마지막으로 고해상도에서 SEM에 기록 됩니다 (몇 나노미터 이미지 픽셀). 리본 처리 도구 어떤 ultramicrotome에 개조 될 수 있는 시연입니다. 그것은 배열 생산 및 단면 칼 보트에서 기판 제거와 함께 도움이 됩니다. Sem에서의 배열 자동된 이미징 허용 하는 소프트웨어 플랫폼을 설명 합니다. 직렬 블록-얼굴 SEM (SBF-SEM) 집중 된 이온 빔 SEM (거짓말-SEM) 등의 큰 볼륨 그들 데이터를 생성 하는 다른 방법에 비해이 방법은 두 가지 주요 이점이 있다: (1) 수 지에 포함 된 샘플은 보존, 이기는 하지만 썬 업 버전. 그것은 다른 방법으로 얼룩진 고 다른 해상도로 촬영 될 수 있습니다. (2)로 섹션 후 얼룩이 질 수 있다, sem의 이미징에 대 한 대비를 소개 하는 조직 블록 전도성 렌더링 중 금속으로 샘플 강하게 블록 스테인드를 사용 하 여 필요는 없습니다. 이것은 메서드를 사용 하면 다양 한 재료와 생물학 질문에 적용할 수 있습니다. 특히 사용된 자료 예를 들어, 생 은행 및 병 리 실험실에서 수 있습니다 직접 포함 되며 3d에서 재구성.
조직 ultrastructural 해상도 큰 볼륨을 재구성을 위해 SEM에 따라 다른 이미징 방식의 번호 사용된1되었습니다: 포괄적인 리뷰는 사용할 수 있는 예., SBF SEM2, 거짓말-sem의3및 배열에 대 한 (에서)4의 tomography 후자의 방법 샘플 자료는 다양 한 기판에 직렬 섹션으로 유지 되지만, SBF SEM과 거짓말-sem의 파괴적인 방법이 있습니다, 샘플 블록에 노력 하 고 이미징 동안 그것을 사용. SEM에 수 지의 충전 때문에 그들은 또한 강력 하 게 금속된 샘플 블록5에 따라 다릅니다.
다른 한편으로, 특정 세포 또는 조직 샘플 내 관심의 구조 식별 특히 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)6,,78에서 이익 수 있습니다. FLM을 사용 하 여 대상에 대 한 걸이 형광 신호9를 끄다 것 때문에 많은 양의 중 금속의 응용 프로그램을 하겠습니다. 이러한만 약간 금속된 샘플에 대 한에 배열 될 수 있습니다 쉽게 후 무거운 금속으로 얼룩진 LM 이미징 후 이후 선택 방법입니다. 또한, 샘플의 거의 모든 종류에서 사용할 수 있습니다, 그리고 심지어 일상적인 샘플의 병리학에서 보물 가슴10.
또 다른 큰 장점은 계층적11 또는 다중 해상도 이미지12에 대 한 잠재력은: 모든 고해상도 이미지를 필요는 없습니다, 목표는 다른 형식 (예를 들어, FLM) 또는 선택할 수 있습니다 저해상도 SEM 이미지입니다. 만 재미 있는 지역 조직 또는 세포 인구에서 고해상도의 이미징 디지털 데이터 저장 공간을 절약 하 고 쉽게 처리 하는 작은 이미지 데이터 세트를 생성. 여기, AT 워크플로 오히려 약하게 금속된 샘플을 사용 하 여 설명 된다: 식물의 뿌리 (애기 thaliana) 냉동 고압 친수성 수 지에 포함 된.
배열 준비, 스테인드, 그리고 FLM에 SEM, 몇 군데 고 이미지 스택을 등록 하는 방법을 설명 합니다. 또한, FLM 볼륨의 3D 개조를 사용 하 여 나노 해상도 sem 이미징에 대 한 특정 셀을 선택 하는 방법을 보여 줍니다.
대상 멀티 모달 계층에 의해 조직 내에서 특정 셀에 대 한 워크플로 시연 했다: 수 지에 포함 된 샘플 사용자 정의 설계 기판 소유자를 사용 하 여 전도성 기판에 배치 되는 직렬 섹션의 배열로 나누기입니다. fluorophore로 후는 FLM에서 이미징, 재건된 볼륨 대상 셀을 선택 하는 데 사용 됩니다. 후 추가 얼룩 대비 소개 중 금속 라운드, 이러한 목표는 SEM는 자동화 된 소프트웨어 플랫폼을 사용 하 여 나노 스케일 해상도에서 몇 백 섹션에 몇 군데는.
생산 몇 가지 긴 리본을 조밀 하 게 포장된 배열, 기판 홀더 여기에 설명 된 것과 비슷한가 필요 합니다. 유능 하 고 환자 사람 연결 하 여러 리본 실리콘 기판, 반 칼 보트에 열 중 하 고 리본 기판에 앉아있을 때까지 점차적으로 수 위를 낮추는 방법으로 배열을 검색할 수 있습니다. 그러나,에 있는 우리의 경험, 기판은 칼 보트 (1.3.2 프로토콜에서에서 참조 참고)의 어떤 부분을 만질 때 형성을 무 너 뜨 리는 경향이 있다. 또한,이 절차는 훨씬 더 어려운 ITO 코팅 기판: (1) 때문에 이토 유리의 투명도, 그것 보고 어렵습니다 물의 가장자리 리본 끝; 첨부 해야 (2) ITO 코팅 표면 고광택된 실리콘 웨이퍼 보다 훨씬 거칠어 있기 때문에, 리본 리프트- 작은 조각 몇 가지 섹션으로 구성 된 플 로트 수 있습니다, 따라서 섹션의 순서를 파괴 하는 동안 휴식 하는 경향이.
전체 워크플로 FLM 데이터에 상관 없이 가능한 이기도합니다. 이 경우에, sem에서 데이터 컬렉션 여러 세션에서 할 수 있습니다. 초기 3D 재구성 또는 적어도 낮은 또는 중간 해상도 데이터의 평가 대상 식별 해야 할 수 있습니다. 또한, 기존의 조직학 얼룩 명시 LM에 대 한 (안 필요한 FLM)을 적용할 수 있습니다. 물론, 다른 옵션6,7,8 은18에 초기 논문에서 이미 시연으로 배열에 라벨 또는 유전자 형광 성 단백질 (XFPs) 인코딩 또는 미리 라벨을 포함 하는 항 체 와 샘플 준비 중 형광의 보전.
설명한 방법의 일반적인 제한은 특정 두께의 섹션 및 3D 볼륨의 결과 개별 샘플링을 사용 하 여: SEM 섹션 표면 (d에서에서 유일한 데이터 수집 이후 Z 해상도 섹션의 두께 만큼 좋은 수 선택 기본 에너지/방문 에너지에 epending). 이 결과 3D 볼륨 이방성 복, 예를 들어있다는 뜻., 100 nm3 경우 100 x 5 x 5 nm 섹션과 이미지 픽셀 크기가 5 nm 사용 됩니다. 1 µ m 아래 크기 범위에서 아주 작은 요소,이 대 한 진정한 ultrastructural 충분 한 않을 수 있습니다. 더 기술적인 한계 이미징 자동 SEM에서 사용 하는 무대의 정확도 이다. 이 때문에, 전체 대상 지역 몇 군데 되도록 무대 정확도의 규격 보다 더 큰 ROI를 선택할 필요가 있다.
블록-얼굴 이미징 방법 SBF SEM과 거짓말-sem의에 비해, 상호에 위에서 설명한 대로 이방성 복의 결정적인 단점이 있다. 거짓말-SEM, 5 nm3 x 5 x 5의 등방성 복 적절 한 드리프트 보정 장소에 있을 때 얻을 수 있습니다.
배열의 준비 하는 동안 섹션의 손실로 인해 재건 볼륨에서 간격 SBF SEM와 거짓말-SEM. 발생 하지 문제가 있을 접착제에 의해 좋은 리본 안정화, 일반적으로 이것이 리본의 마지막 부분에 대 한 문제: 나이프는 속눈썹을 사용 하 여에서 그것을 풀어 놓을 때 손상 될 수 있습니다. 그러나, 우리의 경험의 모든 20-50 단원의 한 부분 손실 않습니다 하지 영향 이미지 등록.
다른 한편으로, 배열 후 얼룩 가능성 좋은 신호 및 SEM 이미징, 여기에 표시 된 루트 팁 냉동 고압 등 약하게 금속된 샘플에도 대비 수 여. 따라서, 수많은 화학 고정 및 금속 단계에 의해 최적의 ultrastructural 보존 타협을 필요는 없습니다. 또한, 중간 정도의 경화와 병 리 실험실에서 일상적인 샘플 우수한 데이터10제공합니다. 일반적으로 이러한 포스트 포함 대비 향상 SBF SEM과 거짓말-sem의 대 한 불가능 하다. 또한, 이러한 메서드는 파괴 하 고, 이후 즉, 이미징, 계층적 다른 해상도 및 사이트에서 이미징 또는 시간에서 나중에 지점에서 반복된 이미징 동안 샘플 사용 불가능 합니다. 원칙적으로, 무제한 볼륨, 큰 FOVs (예를 들어, connectomics에서 전체 마우스 두뇌에 대 한 여러 밀리미터까지)으로 구성 된 모자이크, 바느질에 의해 만들어지고 섹션의 거 대 한 숫자에 거짓말-SEM, 100 µ m x 100 µ m 넘어 FOVs에에서 의해 취득 될 수 있다 일상적인 악기와 함께 달성 하기 어렵다입니다.
SBF SEM과 거짓말-sem의 위에서 언급 한 방법 모두 단면화 및 완전 자동화 된 방식으로 같은 악기 내 이미징 수행 이후 설명에 워크플로 추가 자동화 확실 한 장점 것입니다. 단면 자동화의 한 종류 존재: Kapton 테이프를 사용 하 여 기판 등으로 배열 한 FLM에서 이미지 어렵다 하지만 The ATUMtome12 생성 하 고 수집 섹션의 수천 수 있습니다. 여기에 사용 되는 ITO 코팅 coverslips에 최고 해상도 영상 가능 해야 합니다. 자동화에 대 한 추가, 매우 바람직한 대상 FLM 데이터 스택 기록 될 것 이다. 다른 한편으로, 자동화 비쌀 수 있다 고 기판 홀더를 제외 하면 여기에 제시 된 워크플로 조건 (하드웨어)만 계측 일상적인 EM 실험실 또는 핵심 시설, 낮은 만들기에서 일반적으로 사용할 수 있는 액세스 수준.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 교육과 연구, 프로젝트 MorphiQuant-3 차원에 대 한 독일 연방 내각에서 그랜트 FKZ 13GW0044에 의해 지원 되었다. 기술 지원에 감사 Carolin Bartels 하 고.
Instrumentation | |||
Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sectioning | |||
Razor blades | Plano | T585-V | |
Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
Diamond scriber | Plano | T5448 | |
Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
Brush | Selfmade | ||
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
NaOH pellets | Merck | 106469 | |
1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mounting | |||
Stubs | Plano | G301F | |
Carbon pads | Plano | G3347 | |
Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions/mixtures | |||
Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
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Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
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Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |