大ボリューム内の特定の細胞内標的を見つけるため連続切片的階層構造イメージング

注: サンプルのブロック重合する必要があります、いくつかの重金属が含まれています。固定と1 a 図Bに示すように 2 つのサンプルがされているプロトコルを埋め込むことは別の場所の11に説明。一言で言えば、図 1 aに示されているサンプルは、1% OsO41% 酢酸ウラン、その後、最初とスパー樹脂埋め込みen のブロック染色化学、修正しました。高圧は図 1 bに凍っていた、示されているサンプルを凍結置換アセトン、酢酸ウラニウム 0.4% と Lowicryl HM20 樹脂に埋め込まれました。次の準備ステップ パウダー フリー手袋を使用します。 1. 配列を作成します。 サンプル ブロックのトリミング注: は常に部品を挿入するときにもネジを締めます。 サンプル ブロックを挿入、ウルトラミクロトームのサンプル ホルダー、ホルダー トリミング ブロックに、ウルトラミクロトームの下段にそれをスライドさせます。 サンプルの周りの樹脂の小さな縁のみを残してかみそりの刃で埋め込まれた組織の周り離れて樹脂をトリムします。ターゲットに到達するまで上からトリミングします。注: ブロック面の形状があります台形または長方形 (我々 は正常に両方の図形を使用している)。長方形の長い方の辺をリーディング エッジとトレーリング エッジとしてリボンを安定させる接着剤の混合物で広いエリアをカバーできるように使用することが重要です。 試料ホルダーを挿入、ウルトラミクロトームの腕、下段にナイフ ホルダーしてトリミング ブロックを置き換えます。ダイヤモンド トリム ナイフ (通常 45 °) をナイフ ホルダーに挿入します。ブロック顔トリミング ナイフのエッジに正確に平行に合わせます。メモ: まさに平行リード (下) と末尾の (上端) を生成するために、反対側をトリムするのにはナイフのみを移動します。90 ° トリミング ナイフは、大量 (数百セクション)、有利であります。 すべての 4 つの側面を滑らかにし、リーディング エッジとトレーリング エッジが水平の位置に今、試料ホルダーを回転します。 接着剤の混合物が付いているブロックの先頭と末尾の側面を慎重にコートします。つまようじ13固定いくつかの毛から形成される小さなブラシを使用します。秒以内にこの混合物の溶剤が蒸発するのですぐにこの手順を実行します。この混合物とブロック面を汚染してはなりません。5-10 分のための乾燥コーティング サンプル ブロックができます。注: セクションの多数の (> 200)、時間と、接着剤の膨らみがトレーリング エッジで造り上げるし、潜在的引き戻すセクション ナイフエッジ上のでのみ、リーディング エッジをコートに良いかもしれません。 基板の準備 (約 2 × 2.5 cm2のジャンボ ナイフ) ナイフ ボートに収まるサイズにシリコンウェハーの部分をカットします。必要な場合、マーク ウェーハ部分 (数字または文字) ダイヤモンド スクライバー クリーニングする前に、恒久的なマーカーを洗浄した後。イソプロパノールと糸くずの組織による手動でシリコンウエハをクリーンします。注: 相関イメージング使用インジウム-スズ酸化物 (ITO)-ガラス coverslips をコーティングします。非常に慎重に処理する必要があります、余分なクリーニングは必要ありません。 取り外し可能な接着剤を用いたキャリア プレートの一端に基板を修正します。注: また、基板端が身動き粘着テープの 2 つのストライプを使用してナイフエッジに平行。 プラズマは、親水性の表面を得るための空気と基板 (グロー放電) をアクティブにします。これは、水のドロップが非常に薄膜である (図 2d低接触角) に基板スプレッドに置かれたそのような方法で行ってください。親水化パラメーターによって異なります使用; プラズマ装置ここで使用されるパラメーター、材料表を参照してください。注: プラズマ活性化は非常に不安定、だから基板使用直前にこれを実行します。 ナイフ ボートで基板の最適なぬれ性を達成するためにナイフエッジに近いマウント基板の基板ホルダーのクランプにキャリアを挿入します。注: コンピューター支援設計 (CAD) 図面を含む基板ホルダーの詳細な説明は、ワッカーらに与えられます。11 断面作製 ジャンボ ダイヤモンド ナイフとナイフ ホルダーを挿入逃げ角 (ジャンボ ナイフの 0 °) を設定し、蒸留水でナイフ ボートを埋めます。ナイフをサンプルに 1-2 mm の距離に近づきます。 基板ホルダーのネジ 1-3 (図 2 a) を使って水の中に基板を下げます。喫水線が基板の上から 3 番目にあることを確認します。注: は、基板とキャリア プレート間の接着剤がよく清潔なピンセットで基板に硬化されているを確認します。それを移動しないでください。 シリコンの薄片を使用するときに地面とのクリアランスを見にくいので、それがわかるまで基板を下げるが床に触れます。今基板少量を上げます。基板もキャリアに切削しながらナイフ ボートが触れていることを確認します。 スポイトやピペットを使って船に水のレベルを調整します。両眼を見ながら追加または水表面の全領域、ウルトラミクロトームのトップ光の均一な反射を示すまで水を削除します。 ウルトラミクロトームの下のライトをスイッチします。腕が中間位置で、取り消し、ウルトラミクロトームのハンド ホイールを使用してではないことを確認します。ナイフエッジの反射までサンプルへのアプローチ、ナイフ ブロック面に表示されます。 ナイフをサンプルに合わせて、ウルトラミクロトームの調整オプションを使用します。まず、ナイフを回転させる回転し、サンプルを傾けます。注: 正しく配置される場合はサンプルとナイフの間のギャップを見ることができる光のストライプ (まっすぐな平行線とない楔形) 平行エッジを示しています。 サンプルの傾きをチェック: 光のストライプが太くならないかどうかを確認またはサンプルを上下に移動しながら薄くします。必要な場合は、これを修正するアーク調整ネジを使用します。ブロックの顔のすぐ上 (それはそれを触れていない) まで、サンプルに近いナイフを移動します。 切削速度と切削ウィンドウ コントロール ユニットに (飼料)、切片厚を設定します。 セクショニングを開始します。必要な場合は、最初の完全なセクションがカットされているまでを待ちます。フォーム リボンにくっついているようにするいくつかのセクションをカット (接着剤が再度適用されるそれ以外の場合)。価値の高い飼料を開始 (最大 200 超ナイフの nm) まで最初の完全なセクションがカットされています。その後、目的のフィードの値を設定します。適切なリボンの安定、セクション厚さ 100 nm と切削速度 1 mm/s は良い出発点。最低の達成可能な切片厚が約 60 nm、サンプル品質に応じて。 断面を停止します。ナイフエッジからすべての不要な (一部カット) セクションを削除してまつげ/猫の毛を使用してボートです。小さな破片がたくさんある場合周りに浮かぶピペットで完全に水分を除去し、新鮮な水でボートを満たし。今プロセスは最初の生産的なリボンの準備です。 断面 セクショニングを開始します。数 (実際の数は、セクションおよび基板のサイズによって異なります) のセクションがカットされて、一度セクショニング プロセスを停止し、まつげ14またはより良いまだ、ナイフエッジを優しくなでるナイフエッジからリボンをリリース、非常に猫の毛から柔らかい毛。 操作 (プッシュ/プル) 基板に向かうまつげとリボン、最初のセクションを基板に取り付けます。注: 基板の乾燥部分にくっついてそれまでリボンを優しくプッシュする必要です。 断面と基板にリボンをアタッチする続行します。1 つの側面の開始、各新しいリボンの他に徐々 に移動します。注: は、既に添付しているリボンの緩みを避けるために大規模な水の動きを避けてください。気流の場合も同じです。息盾、ウルトラミクロトームと配信を使用します。不利な環境条件では、15ウルトラミクロトーム用の囲いをお勧めします。 基板は完全にリボンで覆われているとき (通常 4-5 リボンが可能)、優しくリフト アウト基板基板ホルダーのマイクロマニピュレーター ネジを使用してナイフ ボートから。注: 適切な動き、: 垂直方向に持ち上げて (スクリュー 1) (ネジ 3) を回転/傾斜や両方の組み合わせ。 埃のない環境でそれを保存する前に乾燥リボン配列ができます。乾燥後、接着マウント基板、できるだけ早くキャリアから取り外します (同じ日に、それ以外の場合、基板を削除するあまりにも難しいかもしれないまたは取り外す時に壊れる可能性があります)。 2. LM 用染色 注: 異なる染色/ラベリング手法は蛍光プロトコルを含む、可能です。ここで直接、むしろ非特異的な染色は細胞壁の輪郭が選択されます。 Propidium ヨウ化染色 パラフィルムでシャーレ (直径 30 cm) の大きなグラスの底をカバーし、湿気の多い部屋を構築するウェットティッシュで皿の端を並べる。 約 300-500 μ L の coverslip ごとの解決策を使用します。パラフィルムで各 coverslip の一滴を置き、セクションは染色液と接触しているので、ドロップに逆さまガラスを置きます。カバー皿と光からサンプルを保護するためにアルミ箔で包んでください。4 ° C で 16 時間サンプルをインキュベートします。 鉗子で、coverslip を削除し、80 mL の蒸留水で 100 mL ビーカー内を上下移動して洗浄します。新鮮な水と別のビーカーにこの手順を繰り返します。乾燥した圧縮空気で慎重に coverslip。 3. FLM の画像のスタックを記録 一般的な広視野 FLM のステージ上 coverslip の場所。 観察される蛍光の適切なフィルター セット (テーブルの材料) を選択します。 最適な対物レンズを各セクションで、オブジェクトのイメージを取る: ビューのフィールドを入力し、方向を一定に維持しようとします。ルート ヒントの 40 X 空気目的が使用されました。注: リボンが完全にまっすぐではない、回転ステージが撮影中のセクションの方向を変更する助けることができます。可能であれば、特定の機能の画像をセンターまたは記録された画像の端に等距離にあるセクションの端などの機能を維持します。 可能であれば、飽和ピクセルを制限し、露光時間を一定に保つに 16 ビットを使用します。 4. FLM 画像のスタックの登録 仮想スタックとしてフィジー16に一連のイメージをインポートします。 [ファイル] メニューから新しい TrakEM17 (空白) を開きます。 イメージ フィールドを右クリックし、「レイヤーごとの 1 つのスライス」として TrakEM スタックをインポートします。 レイヤー (イメージ フィールドに右クリック) を整列させる、範囲を設定 (最初の最後にイメージ)、参照として [なし] を選択します。すべての設定、既定値を使用し、目的の変換として剛を選択します。 登録が終了し、満足のいく、によって一直線に並べられたデータセットを保存を右クリックし、エクスポート] を選択します。フラット イメージに、範囲を最初から最後の画像に設定し、結果のスタックを表示するソフトウェアします。スタックは、tif 形式で保存します。 5. 染色と SEM イメージングのためのマウント 注: 染色ソリューションを準備する材料の表を参照してください。ソリューションは、光や空気から保護まで 12 ヶ月の間に、4 ° C で保存されるかもしれない。 注意: クエン酸とウラニル酢酸鉛には、有毒な重金属が含まれています。手袋を着用し、自治体の指示に従って廃棄します。 パラフィルムでシャーレ (直径 30 cm) の大きなグラスの底をカバーし、湿気の多い部屋を構築するウェットティッシュで皿の端を並べる。注: 鉛クエン酸の過度の降水量を防ぐために染色の滴近くペトリ皿内 NaOH のいくつかのペレットが位置しているが重要です。 ウラニル アセテート染色 堆積物の小粒子が数秒間 2,680 x g でウラニル酢酸溶液を遠心します。 約 300-500 μ L の coverslip ごとの解決策を使用します。パラフィルムで各 coverslip の一滴を置き、セクションは染色液と接触しているので、ドロップに逆さまガラスを置きます。 室温で 10 分間インキュベート、染色中に料理をカバーしています。 蒸留水をビーカーで上下に移動することによって十分に洗うと鉗子 coverslip でいっぱい削除 (ステップ 2.1.3 を参照してください)。 クエン酸の染色をリードします。 ウラニル酢酸孵卵中における鉛の混合水溶液を準備します。注: 鉛クエン酸は、任意の沈殿物を削除する使用の直前に常にフィルターする必要があります。またステップ 5.2.1 のように数秒間 2,680 x g 鉛クエン酸溶液を遠心します。 約 300-500 μ L の coverslip ごとの解決策を使用します。ウラニル アセテート染色後、coverslips を洗濯する前にすぐに、パラフィルムで各 coverslip の一滴を置き、セクションは染色液と接触しているので、ドロップに逆さまガラスを置きます。ウラニル アセテート染色後、coverslips を洗濯する前にすぐに、パラフィルムの滴 (300-500 μ L) を配置します。注: 沈殿物の形成を避けるためには、息をしていない鉛クエン酸水滴に。 ドロップへ裏返し洗浄 coverslip の場所 (それを乾燥する必要はありません)。 室温で 5 分間インキュベート、染色中に料理をカバーしています。 鉗子で、coverslip を削除し、新鮮な水 (ステップ 5.2.4) ビーカーで上記のようにそれを洗います。 乾燥した圧縮空気で慎重に coverslip。 SEM 用試料を取り付け 粘着性カーボン パッド付きアルミ スタブのシリコン ・ ウェハーをマウントします。注: ito coverslips 可能性がありますいずれかを使用してマウント シルバー塗装と銅テープ、導電性表面がスタブに接続されていることを確認- または上記カーボン パッド。その場合は、シルバー塗装のドロップで ITO 表面からスタブへの導電性接続が可能です。 6. 階層、SEM イメージング 注: 電界放出型、低の一次エネルギーを選択 (3 kV 以下)、セカンダリまたは後方散乱電子の効率的なコレクションの 50 から 800 pA、充電を避けるために、適切な作動距離までの範囲で電流。ビーム電流の選択サンプル プロパティによって異なります (e.g、樹脂を埋め込み);。電子線照射量は微小電流 (サンプルへの害が少ない) と撮影速度のために有益でありしたがって合計画像の取込時間を下げる高電流間の妥協にもなります。後方散乱電子の専用探知機は、良好なコントラストを提供する、サンプルの充電に感受性が低いとサンプルの表面の成果物 (ひだ、ナイフをマーク) の表示。ヒストグラムが中央に配置されるよう、コントラストと明るさを調整する必要があります。 SEM イメージング まず約 100 x の低倍率で各コーナーのイメージを掴んで配列の 4 つのコーナーを定義します。関心 (ROI) アレイ全体を囲む領域を作成します。次のパラメーターでイメージング プロトコルを割り当てる: (例 1,000 nm) の大きな画像のピクセル サイズと短い滞留時間 (例えば、0.2 μ s) で高速撮像、二次電子 (SE) 検出器を使用します。注: で、大規模なスキャンの視野 (FOV)、画像の周辺部で歪みになる可能性があります電子光学的限界を克服するために (ほとんどの SEM の製造業者によって提供される) 専用の低倍率モードを使用または使用中、1 ~ 2 k スキャン フィールド1 つの画像。 最初のセクションで組織だけをまとめた投資収益率を作成すると、セクションを生成します。スタンプ ツールを使用してすべての後続のセクションにクローンを作成します。曲がったリボンに合わせて必要なとき・ ロワを回転させます。 中間的なピクセル サイズを使用してイメージのシリーズを記録 (約 50 nm) と識別し、ターゲットの構造の把握に十分長い時間住む。FOV を 6-10 k ピクセルの範囲の単一のイメージを使用します。注: アトラス 5 ソフトウェアは自動的にシリアルのセクション全体で大規模な投資収益率/セクションの区域をカバーする隣接する画像で構成されるモザイクを収集できます。 高分解能 SEM 用ターゲット構造を含む、このセクション内の設定サイトを作成します。ステージ精度のアカウントに十分な投資収益率を作る。確認し、サイトの位置を調整します。注: それは、オート フォーカスと autostigmation を実行する、センターなしの構造の細部は、例えば「空の」材料の座っていないことそのような方法で Roi を配置することが重要です。、空胞。 オート フォーカス設定を定義し、少なくとものパフォーマンスをチェック (すなわち段階は旅行、最長距離) リボンの長さイメージングされるサイトに近い小さな roi。 高分解能 SEM 獲得のため撮像プロトコルを定義します。膜コンパートメントを表示するには、3-5 nm イメージのピクセル サイズを選択します。検出器によって滞留時間を選択すると、画像はあまりにも騒々しいではありません。 取得を開始する前に少なくともチェック ・ プロトコル ・ オプションを使用して各リボンの最初のセクションにフォーカスの値を定義します。 ターゲット ・ ロワの全体のシリーズで自動の SEM 画像を開始します。 好ましくは tif 形式の画像シリーズとして集録されたデータをエクスポートします。 7. SEM 画像のスタックの登録 仮想スタックとしてフィジーにイメージをインポートします。注: これらのセクションの数と投資収益率の大きさに応じて数 GB の範囲で大きなデータ ファイルになります。 作物 SEM イメージ、できるだけ興味の構造に近い領域にさらなる処理のためのスタックし、明るさとコントラストを調整します。 [ファイル] メニューから新しい TrakEM17 (空白) を開きます。 イメージ フィールドを右クリックし、「レイヤーごとの 1 つのスライス」として TrakEM スタックをインポートします。 (イメージ フィールドに右クリック) レイヤーを整列、モードとして最小二乗法を選択して、範囲を設定 (最初の最後にイメージ)、参照として [なし] を選択します。設定、既定値を使用して目的の変換として剛を選択します。 登録が完了したと満足のいく、によって一直線に並べられたデータセットを保存を右クリックし、エクスポート] を選択します。フラット イメージに、範囲を最初から最後の画像に設定し、結果のスタックを表示するソフトウェアします。スタックは、tif 形式で保存します。