Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen
Summary
Dieses Protokoll zielt auf bestimmte Zellen im Gewebe für die Bildgebung mit nanoskaligen Auflösung mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM). Große Anzahl von Schnittserien aus biologischem Material Harz eingebettet werden zuerst in einem Lichtmikroskop, das Ziel zu identifizieren und dann hierarchisch im SEM abgebildet.
Abstract
Ausrichtung auf bestimmte Zellen in Ultrastrukturforschung Auflösung innerhalb einer gemischten Zellpopulation oder ein Gewebe kann durch hierarchische Bildgebung mit einer Kombination aus Licht- und Elektronenmikroskopie erreicht werden. Proben in Harz eingebettet sind in Arrays bestehend aus Bändern von Hunderten von ultradünnen Abschnitte geschnitten und auf Silizium-Wafer oder leitend beschichtetes Deckgläsern hinterlegt. Arrays werden mit einer niedrigen Auflösung mit einem digitalen Verbraucher wie Smartphone-Kamera oder Lichtmikroskop (LM) für eine rasche großflächige Übersicht oder ein weites Feld Fluoreszenzmikroskop (Fluoreszenz Lichtmikroskopie (FLM)) nach Markierung mit Fluorophore abgebildet. Nach der Post-Färbung mit Schwermetallen, werden Arrays in einem Rasterelektronenmikroskop (REM) abgebildet. Auswahl der Ziele ist möglich von 3D-Rekonstruktionen von FLM generiert oder von 3D-Rekonstruktionen von den SEM Bild Stapeln mit mittlerer Auflösung gemacht, wenn keine fluoreszierenden Marker zur Verfügung stehen. Für Ultrastrukturforschung Analyse ausgewählten Ziele sind schließlich im SEM bei hoher Auflösung aufgezeichnet (wenige Nanometer Bildpixel). Ein Band-Umgang mit Werkzeug, das bei jedem regungsloses nachgerüstet werden kann beweist. Es hilft bei Array-Produktion und Substrat Entfernung vom Boot aus speziellen Messer. Eine Softwareplattform, die ermöglicht die automatisierte Bildverarbeitung von Arrays in die SEM wird diskutiert. Im Vergleich zu anderen großvolumigen EM Datengenerierung, wie z. B. serielle Block-Gesicht SEM (SBF-SEM) oder fokussierten Ionenstrahl SEM (FIB-SEM), dieser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile: (1) die Harz eingebettet Probe konserviert, wenn auch in einer in Scheiben geschnittenen Up-Version. Es kann auf unterschiedliche Weise eingefärbt und mit unterschiedlichen Auflösungen abgebildet. (2) wie in den Abschnitten Post-befleckt werden können, ist es nicht notwendig, Proben stark Block befleckt mit Schwermetallen einzuführen Kontrast für SEM Bildgebung oder machen das Gewebe Blöcke leitfähigen zu verwenden. Dies macht die Methode für eine Vielzahl von Materialien und biologische Fragestellungen. Besonders vorangestellten Materialien z.B.aus Biopsie Banken und Pathologie Labs können direkt eingebettet und in 3D rekonstruiert.
Introduction
Zur Rekonstruktion großer Mengen von Gewebe bei Ultrastrukturforschung Auflösung wurden eine Reihe von verschiedenen bildgebenden Ansätzen basierend auf SEM verwendet1: umfassende Bewertungen sind erhältlich zB. für SBF-SEM2, FIB-SEM3und Array Tomographie (AT)4. Während das Probenmaterial für die letztere Methode als ein Array von Serienschnitte auf einem Substrat erhalten bleibt, sind SBF-SEM und FIB-SEM destruktiven Methoden auf die probenblock arbeiten und konsumieren sie während der Aufnahme. Durch die Erhebung des Harzes in die SEM hängt auch stark metallisierte Probe Blöcke5.
Auf der anderen Seite profitieren Identifizierung bestimmter Zellen oder Strukturen von Interesse in eine Gewebeprobe vor allem von korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM)6,7,8. Mit FLM für targeting schließt die Anwendung von großen Mengen an Schwermetallen da das Fluoreszenz-Signal9stillen würde. Für solche nur leicht metallisierten Proben ist AT die Methode der Wahl, da Arrays nach dem LM Imaging leicht Post-gebeizt mit Heavy Metal sein können. Darüber hinaus fast jede Probenart verwendet werden, für AT, sogar Routineproben aus der Pathologe Schatz Brust10.
Ein weiterer großer Vorteil der AT ist das Potenzial für hierarchische11 oder Multi-Resolution imaging12: Es ist nicht notwendig, alles im hochauflösenden Bild, als Ziele können, in einer anderen Modalität (z.B.FLM) oder in ausgewählt werden SEM-Bilder mit niedriger Auflösung. Nur die interessanten Regionen einer Gewebe- oder Bevölkerung an hochauflösenden Bildgebung digitale Daten-Speicherplatz spart und produziert kleinere Bild-Datensätzen, die einfacher zu handhaben sind. Hier die AT-Workflow zeigt sich mit einer eher schwach metallisierte Stichprobe: Hochdruck eingefroren Pflanzenwurzeln (Arabidopsis Thaliana) in hydrophilen Harz eingebettet.
Wie die Arrays sind vorbereitet, gebeizt und im FLM und SEM abgebildet, und wie die Bild-Stacks registriert sind, werden erläutert. Auch, wie der 3D-Rekonstruktion des FLM Volumes verwendet werden kann, bestimmte Zellen für die Bildgebung in der SEM mit nanoskaligen Auflösung auswählen wird dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Workflow für die Ausrichtung auf bestimmte Zellen in einem Gewebe von Multi-modale hierarchische AT zeigte: eine Probe Harz eingebettet in Arrays von Schnittserien, die auf einem leitfähigen Substrat mit einem maßgeschneiderten Substrat Halter platziert werden zerschnitten ist. Nach Markierung mit einem Fluorophor und Bildgebung in der FLM, dient das rekonstruierte Volumen für die Auswahl der Zielzellen. Nach zusätzlichen Färbung mit Schwermetallen runden, Kontrast einzuführen, sind diese Ziele über mehrere hundert Abschnitte mit nanoskaligen Auflösung in einem SEM mit einer automatisierten Software-Plattform abgebildet.
Für die Herstellung von dicht gepackten Arrays mit mehreren langen Bändern, ist Inhaber eines Substrat ähnlich der hier beschriebenen notwendig. Eine qualifizierte und geduldige Person möglicherweise mehrere Bänder an Silizium-Substrat, halb eingetaucht in das Messer Boot anhängen und das Array abrufen, indem Sie nach und nach Senkung des Wasserspiegels bis die Bänder auf dem Substrat sitzen. Jedoch in der nach unserer Erfahrung gibt es eine Tendenz zur Bildung zu zerbrechen, wenn das Substrat Teil des Bootes Messer (vgl. Note 1.3.2 im Protokoll) berührt. Darüber hinaus ist dieses Verfahren sehr viel schwieriger mit ITO-beschichtete Substrate: (1) aufgrund der Transparenz der ITO-Glas, ist es schwierig, den Rand des Wassers zu sehen, wo die Enden der Bänder müssen befestigt sein; (2) da die ITO-beschichtete Oberfläche viel rauer als die Hochglanz polierte Siliziumwafer ist, die Bänder sind in der Regel, während Lift-out- und kleinere Fragmente, bestehend aus ein paar teilen können schweben, so zerstören die Reihenfolge der Abschnitte zu brechen.
Der gesamte Workflow ist auch möglich ohne Korrelation zur FLM Daten. In diesem Fall möglicherweise Datenerhebung im SEM in mehreren Sitzungen durchgeführt werden. Eine erste 3D Rekonstruktion oder zumindest Auswertung der Daten mit geringer oder mittlerer Auflösung kann erforderlich sein, Ziele zu identifizieren. Darüber hinaus können konventionelle histologische Flecken für Hellfeld LM (nicht erfordern FLM) angewendet werden. Natürlich sind andere Optionen6,7,8 Antikörper Kennzeichnung in den Arrays, wie bereits in dem ersten Dokument über18, oder genetisch codiert fluoreszierende Proteine (XFPs) oder Pre-einbetten Kennzeichnung mit der Erhaltung der Fluoreszenz während der Probenvorbereitung.
Eine allgemeine Einschränkung der diskutierte Methode ist die Verwendung von Abschnitten einer bestimmten Dicke und die daraus resultierende diskrete Probenahme das 3D-Volumen: Auflösung in Z kann nur so gut sein wie die Dicke der Abschnitte sein, da das SEM nur Daten aus der Abschnitt Oberfläche (d sammelt Epending auf die primäre Energie/Landung Energie ausgewählt). Dies bedeutet, dass die daraus resultierenden 3D-Volumen anisotropen Voxel, zB., 5 x 5 x 100 nm3 wenn 100 nm Abschnitte und eine Bild-Pixel-Größe von 5 nm verwendet. Für sehr kleine Unternehmen in einem Größenbereich unter 1 µm kann dies nicht für eine wahre Ultrastrukturforschung Beschreibung ausreichen. Eine weitere technische Einschränkung ist die Genauigkeit der Bühne verwendet im SEM für automatisierte imaging. Aus diesem Grund ist es notwendig, wählen einen ROI größer als die Spezifikationen der Bühne Genauigkeit zu gewährleisten, dass das gesamte Zielgebiet abgebildet wird.
Im Vergleich zum SBF-SEM und FIB-SEM als Block-Gesicht bildgebenden Verfahren, hat korrelative AT den endgültigen Nachteil anisotropen Voxel, wie oben beschrieben. Mit FIB-REM isotrope Voxel von 5 x 5 x 5 nm3 erhalten Sie bei eine richtigen Drift-Korrektur.
Lücken in der rekonstruierten Volumen durch den Verlust der Abschnitte während der Vorbereitung des Arrays könnten auch ein Anliegen, die nicht mit SBF-SEM oder FIB-SEM begegnet ist Mit einer guten Band Stabilisierung durch Kleber, ist dies in der Regel nur ein Problem für den letzten Abschnitt eines Bandes: beschädigt werden, wenn es aus der Messers Schneide mit der Wimper zu veröffentlichen. Allerdings beeinflusst der Verlust eines Abschnitts in jeder 20 – 50 Abschnitten nach unserer Erfahrung nicht Bild-Registrierung.
Auf der anderen Seite verleiht die Möglichkeit, Arrays nach dem Färben gutes Signal und Kontrast für SEM Bildgebung auch auf schwach metallisierte Proben wie der Hochdruck Wurzelspitzen, die hier gezeigte eingefroren. Daher ist es nicht optimale Ultrastrukturforschung Konservierung durch zahlreiche chemische Fixierung und Metallisierung Schritte Kompromisse notwendig. Darüber hinaus liefern Routineproben aus der Pathologie-Labor mit einem mittleren Grad an Metallisierung hervorragende Daten10. Ein Post-Einbettung Kontrastverstärkung ist generell nicht möglich für SBF-SEM und FIB-SEM. Außerdem, da diese Methoden destruktiv sind, ist d.h., verbrauchen die Probe während der Bildgebung, hierarchische imaging bei verschiedenen Auflösungen und Websites oder wiederholte Bildgebung zu späteren Zeitpunkten in der Zeit unmöglich. Im Prinzip unbegrenzte Mengen, bestehend aus großen FOVs (z. B.bis zu mehreren Millimetern für ganze Mäusegehirnen in Connectomics) erstellt durch Nähte Mosaiken und eine Vielzahl von Abschnitten von AT, während im FIB-SEM, FOVs über 100 µm X 100 µm erworben werden können sind schwer zu erreichen mit Routine Instrumente.
Weiteren Automatisierung des beschriebenen AT-Workflows wäre ein klarer Vorteil, da die oben genannten Methoden SBF-SEM und FIB-SEM sowohl schneiden und Bildgebung innerhalb desselben Instruments in einer vollständig automatisierten Weise durchführen. Gibt es eine Art der Automatisierung der Schneiden: The ATUMtome12 können generieren und Tausende von Abschnitten zu sammeln, aber die Verwendung von Kapton Klebeband wie ein Substrat solche macht arrays schwierig, Bild in ein FLM. Auf die ITO-beschichtete Deckgläsern hier verwendet sollte auch super-Auflösung möglich sein. Eine weitere, sehr wünschenswerte Ziel für Automatisierung wäre die Aufnahme der FLM-Daten-Stacks. Auf der anderen Seite Automatisierung kann teuer sein und mit Ausnahme des Substrat-Inhabers der hier vorgestellten Workflow hängt (in Bezug auf die Hardware) nur Instrumentierung in der Regel verfügbar in einer Routine EM Labor oder Core Einrichtung, so dass es niedrige Ebene Zugriff.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Grant FKZ 13GW0044 vom Bundesministerium für Bildung und Forschung, Projekt MorphiQuant-3D unterstützt. Wir danken Carolin Bartels für den technischen Support.
Materials
| Instrumentation | |||
| Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
| Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
| Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
| Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
| Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
| Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
| Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
| FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sectioning | |||
| Razor blades | Plano | T585-V | |
| Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
| Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
| Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
| ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
| Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
| Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
| Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
| Diamond scriber | Plano | T5448 | |
| Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
| Brush | Selfmade | ||
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
| Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
| Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
| Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
| Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
| Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
| Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
| Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
| Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
| NaOH pellets | Merck | 106469 | |
| 1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
| Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting | |||
| Stubs | Plano | G301F | |
| Carbon pads | Plano | G3347 | |
| Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
| Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions/mixtures | |||
| Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
||
| Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
||
| Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
| Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |
References
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