本协议以扫描电镜 (SEM) 为目标, 以纳米尺度分辨率成像组织中的特定细胞为靶点。从树脂嵌入的生物材料中, 大量的系列部分首先在光学显微镜中被成像, 以识别目标, 然后以分层的方式在 SEM 中。
通过使用光和电子显微术的分级成像, 可以实现在混合细胞群或组织内超微结构分辨率的特定细胞的靶向。嵌入在树脂中的样品被切片成由数以百计的超薄切片的丝带组成的阵列, 并沉积在硅片或 conductively 涂层盖玻片上。阵列被成像低分辨率使用数字消费者, 如智能手机相机或光学显微镜 (LM) 快速大面积概述, 或广泛的领域荧光显微镜 (荧光显微镜 (FLM)) 后, 标签与显影。经过重金属染色后, 阵列在扫描电子显微镜 (SEM) 中成像。如果没有荧光标记, 则可以从 FLM 生成的3D 重建或从扫描电镜图像栈中的3D 重建中选择目标。对于超微结构分析, 在高分辨率的扫描电镜中最终记录了选定的目标 (一些纳米图像像素)。可以对任何 ultramicrotome 进行改装的功能区处理工具。它有助于与阵列生产和基板去除从切片刀船。本文讨论了一种允许在 SEM 中自动成像阵列的软件平台。与其他产生大体积 EM 数据的方法相比, 如串行块面扫描电镜 (SBF sem) 或聚焦离子束扫描电镜 (sem), 这种方法有两大优点: (1) 树脂嵌入样品保存, 尽管切片版本。它可以用不同的方式染色, 并以不同的分辨率进行成像。(2) 由于切片可以被染色后, 没有必要使用强块状的样品与重金属进行对比, 以介绍 SEM 成像或使组织块导电。这使得该方法适用于各种材料和生物问题。特别是前缀材料例如, 从活检银行和病理实验室, 可以直接嵌入和重建3D。
在超微结构下重建大体积组织的研究已使用了许多基于 SEM 的不同成像方法1: 可使用的全面评论e. g., SBF-sem2, 谎言-sem3, 和阵列层析成像 (AT)4。而对于后一种方法, 样品材料被保留为一系列的序列部分在基板上, SBF 扫描电镜和表面扫描电镜是破坏性的方法, 工作在样品块和消耗它在成像过程中。由于在 SEM 中的树脂充电, 它们也依赖于强金属样本块5。
另一方面, 在组织样本中识别某些细胞或结构可能会从相关的光和电子显微镜 (克莱)6,7,8中获利。使用 FLM 的目标, 排除了大量重金属的应用, 因为这将淬火荧光信号9。对于这样只稍微金属的样品, 在是选择的方法, 因为阵列可能很容易后染重金属后, LM 成像。此外, 几乎任何样本类型可以用于, 甚至例行样本从病理学家的宝箱10。
另一个很大的优点是分层11或多分辨率成像12的潜力: 没有必要在高分辨率下映像所有内容, 因为可以在不同的模式 (例如、FLM) 中选择目标, 或者在低分辨率 SEM 图像。只对高分辨率的组织或细胞群感兴趣的区域进行成像, 可以节省数字数据存储空间, 并生成较小的图像数据集, 更易于处理。在这里, 在工作流演示使用一个相当弱的金属样品: 高压冷冻植物根 (拟南芥) 嵌入亲水性树脂。
如何在 FLM 和 SEM 中对阵列进行准备、染色和成像, 以及如何注册图像栈。此外, FLM 体积的3D 重建如何可以用来选择特定的细胞, 在扫描电镜的纳米分辨率。
通过多模态分层的方法对组织内特定细胞的工作流进行了演示: 将树脂嵌入的样品切片成一系列的串口, 这些切片被放置在导电基板上, 使用定制设计的衬底架。在 FLM 的荧光和成像标记后, 重建的体积用于选择目标细胞。在额外的染色轮与重金属引入对比, 这些目标是成像在几个百个部分, 在纳米分辨率的 SEM 使用一个自动化的软件平台。
为生产密被包装的数组与几个长的丝带, 与这里描述的一个衬底持有人是必要的。一个有技能和耐心的人可能会把几个丝带连接到一个硅基板上, 半浸入刀船中, 并通过逐渐降低水位来检索阵列, 直到丝带坐在基板上。然而, 根据我们的经验, 有一种倾向, 粉碎形成时, 基板接触的任何部分的刀船 (cf. 注意在1.3.2 中的协议)。此外, 该程序是更困难的 ito 涂层基体: (1) 由于 ito 玻璃的透明度, 很难看到边缘的水, 其中的丝带两端必须连接;(2) 由于 ITO 涂层表面比高度抛光的硅片粗糙得多, 在升力的过程中, 缎带往往会断裂,而由少数部分组成的小碎片则可能浮动, 从而破坏了节的顺序。
整个工作流也是可行的, 不与 FLM 数据相关。在这种情况下, 扫描电镜中的数据收集可能需要在几个会话中进行。为了确定目标, 可能需要进行初始3D 重建或至少评估低或中分辨率数据。此外, brightfield LM (不需要 FLM) 的常规组织学污渍也可以应用。当然, 其他选项6,7,8是阵列上的抗体标记, 如在18的初始文件中所示, 或基因编码的荧光蛋白 (XFPs) 或预嵌入标记在样品制备过程中保存荧光。
所讨论的方法的一般限制是使用一定厚度的截面和产生的3D 体积的离散采样: Z 分辨率只能与截面厚度一样好, 因为 SEM 只收集截面表面的数据 (depending 在主要能量/着陆能量选择了)。这意味着产生的3D 卷具有各向异性素, e. g, 5 x 5 x 100 nm3 , 如果使用 100 nm 部分和一个图像像素大小 5 nm。对于大小范围小于1µm 的非常小的实体, 这可能不足以实现真正的超微结构描述。一个更技术性的限制是在扫描电镜中用于自动成像的阶段的准确性。因此, 有必要选择比舞台精度规格更大的 ROI, 以保证整个目标区域的成像。
与 SBF-sem 和表面扫描电镜相比较的块面成像方法相比, 相关的是各向异性素的最终缺点, 如上文所述。用素-SEM, 当适当的漂移校正到位时, 可以获得 5 x 5 x 5 nm3的各向同性的。
在阵列制备过程中由于部分损失而重建体积的空隙也可能是 SBF-sem 或颤电镜没有遇到的问题。用胶水稳定的丝带, 这通常只是一个问题, 在丝带的最后一节: 它可能会被损坏时, 从刀刃上使用睫毛。但是, 按照我们的经验, 每个20–50节中的一个部分的丢失不会影响图像的注册。
另一方面, 染色后阵列的可能性给出了扫描电镜成像的良好信号和对比度, 即使是在弱金属样品上, 如这里所示的高压冰冻根尖。因此, 不需要通过大量的化学固定和金属化步骤来破坏最佳超微结构保存。此外, 从病理实验室的常规样品, 中间金属化提供了优秀的数据10。这样的后嵌入对比增强是不可能的 SBF 扫描电镜和谎言-sem 一般。此外, 由于这些方法具有破坏性,即, 在成像过程中消耗样本, 在不同的分辨率和地点进行分层成像, 或者在以后的时间点重复成像是不可能的。原则上, 无限卷, 包括大 FOVs (例如, 由几毫米为整个老鼠脑子在 connectomics) 由缝合马赛克创造, 并且大量的部分可以获得通过在, 而在说谎-SEM, FOVs 在100µm x 100 µm 以后很难用常规仪器实现。
在工作流中所描述的进一步自动化将是一个明确的优势, 因为上述方法 SBF-sem 和颤像-sem 在同一仪器中以全自动的方式执行切片和成像。一种切片的自动化存在: ATUMtome12可以生成和收集数以千计的节, 但使用 Kapton 磁带作为基板使此类阵列难以在 FLM 中进行图像处理。在这里使用的 ITO 涂层盖玻片, 即使是超分辨率成像也应该是可能的。另一个非常理想的自动化目标是记录 FLM 数据栈。另一方面, 自动化可能是昂贵的, 除了基板持有者, 这里提出的工作流仅依赖于通常在常规 EM 实验室或核心设备中可用的检测工具, 从而使其低级别访问。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了德国联邦教育和研究部项目 MorphiQuant-3D 的赠款 FKZ 13GW0044 的支持。我们感谢 Carolin 巴特尔的技术支持。
Instrumentation | |||
Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sectioning | |||
Razor blades | Plano | T585-V | |
Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
Diamond scriber | Plano | T5448 | |
Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
Brush | Selfmade | ||
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
NaOH pellets | Merck | 106469 | |
1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mounting | |||
Stubs | Plano | G301F | |
Carbon pads | Plano | G3347 | |
Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions/mixtures | |||
Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
||
Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
||
Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |