Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme
Summary
Bu iletişim kuralı bir Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak Nano çözünürlükte görüntüleme için bir doku belirli hücreleri hedef alıyor. Biyolojik malzeme reçine gömülü seri bölümleri çok sayıda hedefi tanımlamak için bir ışık mikroskobu ve sonra SEM hiyerarşik bir düzen izler ilk görüntüsü
Abstract
Bir karma hücre grubun veya bir doku içinde ultrastructural çözünürlükte belirli hücreleri hedefleme bir ışık ve elektron mikroskobu kullanarak hiyerarşik görüntüleme tarafından elde edilebilir. Reçine gömülü örnekleri ultrathin bölümleri yüzlerce kurdela oluşan diziye kesitli ve silikon gofret veya conductively kaplı coverslips parçaları yatırılır. Dizileri düşük çözünürlükte bir dijital tüketici smartphone kamera veya hızlı geniş alanı genel bakış için ışık mikroskobu (LM) veya geniş alan floresan mikroskop (Floresan ışık mikroskobu (FLM)) gibi fluorophores ile etiketleme sonra kullanarak yansıma. Ağır metaller ile sonrası sonra boyama, diziler bir Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüsü. Hedeflerin seçimi 3D rekonstrüksiyonlar FLM tarafından oluşturulan veya floresan hiçbir işaretleri yoksa SEM görüntü yığınları orta çözünürlükte yapılmış 3D rekonstrüksiyonlar mümkündür. Ultrastructural analiz için seçilen hedefleri sonunda yüksek çözünürlüklü, SEM kaydedilir (bir kaç nanometre görüntü piksel). Herhangi bir ultramicrotome için güçlendirilmiş bir şerit işleme aracı gösterilmiştir. Bu dizi üretim ve parça bıçak tekne substrat kaldırılması ile yardımcı olur. SEM dizilerin otomatik görüntüleme sağlayan bir yazılım platformu ele alınmıştır. Seri blok-yüz SEM (SBF-SEM) veya odaklı iyon demeti SEM (FIB-SEM), gibi büyük hacimli EM verileri oluşturan diğer yöntemlere göre bu yaklaşım iki önemli yararı vardır: (1) reçine gömülü örnek, dilimlenmiş-up versiyonu da olsa korunmuş. Farklı şekillerde lekeli ve farklı çözümler sunarak görüntüsü. (2) gibi bölümler sonrası Boyanabilen, kontrast için SEM düşsel tanıtmak veya doku blok iletken işlemek için ağır metaller ile örnekleri güçlü blok lekeli kullanmak gerekli değildir. Bu yöntem çok çeşitli malzeme ve biyolojik sorular için geçerli hale getirir. Özellikle önekli malzemeler örneğin, biyopsi bankalar ve patoloji laboratuarları, doğrudan olabilir gömülü ve 3D yeniden.
Introduction
Doku ultrastructural çözünürlükte geniş hacimli yeniden inşa için SEM dayalı farklı görüntüleme yaklaşımlar bir dizi olmuştur kullanılan1: kapsamlı değerlendirmeleri vardır kullanılabilir örn., SBF-SEM2, FIB-SEM3ve dizi Tomografi (AT)4. İkinci yöntem için örnek malzeme seri bir substrat bölümlerde dizisi olarak korunur, SBF-SEM ve FIB-SEM yıkıcı yöntemleri, örnek blokta çalışma ve görüntüleme sırasında alıcı iken. SEM reçine şarj nedeniyle, onlar da şiddetle metalize örnek blok5üzerinde bağlıdır.
Öte yandan, belirli hücreleri veya doku örneği içinde faiz yapılarının belirlenmesi özellikle Bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM)6,7,8yararlanabilirsiniz. Bu floresan sinyal9gidermek beri FLM için hedefleme kullanarak uygulama heavy metal büyük miktarda engellemektedir. Diziler LM görüntüleme sonra kolayca sonrası heavy metal ile lekeli olabilir beri böyle sadece biraz metalize örnekleri için AT yönteminin seçimi var. Ayrıca, hemen hemen her örnek türü için kullanılabilir, patolog’ın bile rutin örnekleri göğüs10hazine.
AT bir diğer büyük avantajı hiyerarşik11 veya çoklu çözünürlük görüntüleme12için potansiyel mevcuttur: her şeyde yüksek çözünürlüklü görüntü gerek yoktur, hedefleri farklı bir yöntem (örneğin, FLM) ya da seçilebilir düşük çözünürlüklü SEM görüntüleri. Sadece ilginç bölgeleri, yüksek çözünürlüklü bir doku veya hücre nüfusunun görüntüleme dijital veri depolama alanı kaydeder ve kolay olan daha küçük görüntü veri kümeleri üretir. Burada, oldukça zayıf metalize bir örnek kullanarak AT iş akışı gösterilmiştir: yüksek basınç bitki kökleri (Arabidopsis thaliana) dondurulmuş gömülü hidrofilik reçine.
Diziler hazırlanan, lekeli ve FLM ve SEM görüntüsü ve görüntü yığınları kayıtlı nasıl açıklanmıştır. Ayrıca, FLM birim 3D yeniden inşası SEM Nano çözünürlükte görüntüleme için belirli hücreleri seçmek için nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir doku Multi-Modal hiyerarşik AT tarafından içindeki belirli hücreleri hedefleme için bir iş akışı gösterilmiştir: reçine gömülü bir örnek, bir özel tasarlanmış substrat tutucu kullanarak iletken bir substrat yerleştirilen seri kesitler, bir dizi içine doğradı. Bir fluorophore ile etiketleme ve FLM görüntüleme sonra yeniden oluşturulan birim hedef hücreleri seçmek için kullanılır. Ek boyama ağır metaller ile kontrast tanıtmak için tur sonra bu hedefleri bir SEM bir otomatik yazılım platformu kullanarak Nano çözünürlükte birkaç yüz bölüm üzerinde görüntüsü.
Birkaç uzun şeritler yoğun dolu diziler üretmek için burada açıklanan benzer bir substrat tutucu gereklidir. Yetenekli ve sabırlı kişi birkaç şeritler bıçak tekne yarı dalmış bir silikon yüzey ekleyin ve kurdeleler yüzey üzerinde oturuyorsun kadar yavaş yavaş su seviyesini düşürerek dizi almak mümkün olabilir. Ancak, bizim deneyim ne zaman belgili tanımlık substrate bıçak tekne (1.3.2 protokolündeki cf. Not) herhangi bir bölümünü dokunuyor oluşumu paramparça için bir eğilim vardır. Buna ek olarak, bu yordam ITO kaplı yüzeyler ile çok daha zor olacaktır: (1) ITO-cam şeffaflık nedeniyle su kenarı kurdele uçlarını iliştirilecek; olduğu görmek zordur ve (2) ITO kaplı yüzey çok parlak silikon gofret kadar kaba olduğu için kurdeleler bölümlerin sırasını böylece yok edip Asansör-out ve birkaç bölümden oluşan daha küçük parçaları savrulabilirsırasında kırmak eğilimindedir.
Tüm iş akışı da korelasyon FLM veri olmadan mümkün olabilir. Bu durumda, veri toplama SEM içinde çeşitli oturumlarda yapılması gerekebilir. İlk 3D yeniden yapılandırma ya da en azından düşük veya orta çözünürlükte veri değerlendirme hedefleri tanımlamak gerekli olabilir. Buna ek olarak, aydınlık alan LM için geleneksel histolojik lekeleri (değil gerektiren FLM) uygulanabilir. Zaten18, ilk kağıt üzerinde gösterdiği gibi diziler üzerinde etiketleme veya genetik olarak flüoresan proteinleri (XFPs) kodlanmış veya etiketleme önceden katıştırma antikor are-in yön, diğer seçenekleri6,7,8 Floresans numune hazırlama sırasında korunması ile.
Belirli bir kalınlık bölümlerini ve 3B cilt elde edilen ayrık örnekleme kullanımı genel kısıtlamasıdır tartışılan yöntem: Z de çözüm sadece olabilir bölümleri kalınlık olarak iyi SEM tek veri bölümü yüzeyden (d toplar bu yana epending Seçili birincil enerji/açılış enerji). Bu elde edilen 3B cilt Anizotropik voxels, e.golduğu anlamına gelir., 5 x 5 x 100 nm3 Eğer 100 nm bölümleri ve bir görüntü piksel boyutu 5 nm kullanılır. Bir boyut aralığı 1 µm aşağıda çok küçük varlıklar için bu gerçek bir ultrastructural açıklama için yeterli olmayabilir. SEM Imaging otomatik için kullanılan sahne doğruluğunu daha teknik bir kısıtlamadır. Bu nedenle, tam hedef alan görüntüsü güvence altına almak için bir yatırım Getirisi daha büyük sahne doğruluk özellikleri seçmek gereklidir.
SBF-SEM ve FIB-SEM blok suratlı görüntüleme yöntemleri olarak göre Bağdaşık Anizotropik voxels, yukarıda açıklandığı gibi kesin bir dezavantajı vardır. Ne zaman uygun drift düzeltme yer FIB-SEM ile 5 x 5 x 5 nm3 izotropik voxels elde edilebilir.
Yeniden oluşturulan birimin bölümler diziler hazırlanması sırasında kaybı nedeniyle boşluklar da SBF-SEM veya FIB-SEM ile karşılaştı değil bir endişe olabilir Tutkal tarafından iyi şerit stabilization ile bu genellikle sadece bir Şerit’in son bölümü için bir sorun: ne zaman serbest bırakmak o kirpik kullanarak knife-edge hasar görmüş. Ancak, deneyim, her 20 – 50 bölümlerde bir bölümünün kaybı görüntü kayıt etkilemez.
Öte yandan, diziler sonrası leke imkanı iyi sinyal ve kontrast için kök ipuçları burada gösterilen donmuş yüksek basınç gibi zayıf metalize örnekleri üzerinde bile SEM düşsel confers. Bu nedenle, çok sayıda kimyasal fiksasyonu ve metallization adımları tarafından en iyi ultrastructural korunması tehlikeye gerek yoktur. Ayrıca, orta derece metallization olan patoloji laboratuarından rutin örnekleri mükemmel veri10teslim. Sonrası gömme kontrast geliştirme genel olarak SBF-SEM ve FIB-SEM için mümkün değildir. Bu yöntemler yıkıcı olduğundan, Ayrıca, Yani, örnek görüntü, farklı çözünürlüklerde ve siteleri görüntüleme hiyerarşik veya zaman içinde daha sonra noktalarda tekrarlanan görüntüleme sırasında tüketmek mümkün değildir. Prensip olarak, sınırsız birim, büyük FOVs (örneğin, connectomics tüm fare beyinlerinde için birkaç milimetre kadar) oluşan mozaikler dikiş tarafından oluşturulan ve bölümler çok büyük sayılara AT, FIB-SEM iken, FOVs 100 µm x 100 µm ötesinde tarafından elde edilebilir rutin araçlarıyla ulaşmak zordur.
Yukarıda belirtilen yöntem SBF-SEM ve FIB-SEM hem kesit ve tam otomatik bir şekilde aynı araç içinde görüntüleme gerçekleştirmek daha fazla otomasyon iş akışının açıklandığı AT-bir avantaj olacaktır. Otomasyon kesit, bir tür var: ATUMtome12 oluşturmak ve bölümler binlerce toplamak, ama böyle bir substrat yapar gibi Kapton Teyp kullanımını zor bir FLM görüntüde diziler. ITO kaplı coverslips burada kullanılan üzerinde bile süper kararlılık düşsel mümkün. Otomasyon için daha fazla, çok istenen hedef FLM veri yığınları kayıt olurdu. Öte yandan, otomasyon pahalı olabilir ve substrat sahibi dışında burada sunulan iş akışı (donanım açısından) sadece araçları düşük yapma bir rutin EM laboratuvar veya çekirdek tesis, genellikle mevcut dayanan düzey erişim.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser grant FKZ 13GW0044 Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma, proje MorphiQuant-3D için desteklenen bir durumdu. Carolin Bartels teknik destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Instrumentation | |||
| Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
| Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
| Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
| Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
| Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
| Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
| Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
| FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sectioning | |||
| Razor blades | Plano | T585-V | |
| Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
| Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
| Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
| ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
| Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
| Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
| Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
| Diamond scriber | Plano | T5448 | |
| Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
| Brush | Selfmade | ||
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
| Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
| Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
| Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
| Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
| Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
| Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
| Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
| Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
| NaOH pellets | Merck | 106469 | |
| 1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
| Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting | |||
| Stubs | Plano | G301F | |
| Carbon pads | Plano | G3347 | |
| Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
| Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions/mixtures | |||
| Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
||
| Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
||
| Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
| Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |
References
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience. J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
- Wacker, I., Schröder, R. R. Array tomography. J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).
- Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).
- Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures. Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Verkade, P., Müller-Reichert, T. . Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1-352 (2017).
- Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -. M. Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design. Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).
- Wacker, I., Schröder, R. R., Schroeder, J. A. Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample. Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).
- Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schröder, R. R. Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biol. 17 (1), 38 (2016).
- Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, (2014).
- Micheva, K. D., O’Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. Array Tomography: Production of Arrays. Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).
- Fahrenbach, W. H. Continuous serial thin sectioning for electron microscopy. J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).
- Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
