Proyección de imagen multimodal jerárquica de secciones seriadas para encontrar dianas celulares específicas dentro de grandes volúmenes

Nota: Muestra los bloques deben ser polimerizados y contienen algunos metales pesados. Fijación y embebido de protocolos para las dos muestras que se muestra en la figura 1A-B se han describen en otra parte11. En Resumen, la muestra que se muestra en la figura 1A se fijó químicamente, teñidos en bloque primero con 1% OsO4, luego con el 1% acetato de uranilo y embebida en resina de Spurr. La muestra se muestra en la figura 1B se alta presión congelada, congelar sustituidos con acetato de uranilo de 0.4% en acetona y embebida en resina Lowicryl HM20. Utilice guantes sin talco para los pasos de preparación. 1. creación de matrices Corte del bloque de muestraNota: Apriete siempre los tornillos bien al insertar piezas. Inserte el bloque de muestra en el portamuestras de la ultramicrotomía, coloque el soporte en el bloque de ajuste y deslice en la etapa más baja de la ultramicrotomía. Adorno resina lejos alrededor del tejido embebido con una cuchilla dejando solo un pequeño borde de resina alrededor de la muestra. Recorte de la parte superior hasta llega a la meta.Nota: La forma de la cara de bloque puede ser trapezoidal o rectangular (nosotros hemos utilizado con éxito ambas formas). Es importante utilizar los lados más largos del rectángulo como el líder y el borde de fuga para asegurarse de que un área está cubierto por la mezcla de pegamento que estabiliza las cintas. Inserte el soporte de la muestra en el brazo de la ultramicrotomía y reemplace el bloque de corte en la etapa inferior de soporte de la cuchilla. Inserte un cuchillo de corte de diamante (normalmente 45°), soporte de la cuchilla. Alinee la cara de bloque exactamente paralela al borde de cuchillo de corte.Nota: Para producir exactamente paralelo (parte inferior) y líderes trailing bordes (superiores), girar o mover sólo la cuchilla para recortar los lados opuestos. Para volúmenes grandes (más de varios cientos secciones), un cuchillo de corte de 90° es ventajoso. Suavizar los cuatro lados, luego gire el sostenedor de la muestra para que el borde de fuga y líderes están ahora en posición horizontal. Cubra cuidadosamente los lados principales y al final del bloque con mezcla adhesiva. Utilice un cepillo pequeño formado de pelos unos fijado a un palillo de dientes13. Realizar este paso rápidamente, porque el solvente de esta mezcla se evapora en segundos. No contamine el bloque de cara con esta mezcla. Deje que se seque durante 5-10 min el bloque de muestras revestidas.Nota: para un mayor número de secciones (> 200), puede ser mejor cubrir el borde solamente, porque con el tiempo, un bombeo de cola podría construir en el borde de fuga y potencialmente tire las secciones sobre el filo de la navaja. Preparación del sustrato Cortar las obleas de silicio a un tamaño que encaja en el barco de cuchillo (aproximadamente 2 x 2, 5 cm2 para el cuchillo Jumbo). Si es necesario, marcar los trozos de oblea (números o letras) con una punta de trazar del diamante antes de limpiar o con marcador permanente después de la limpieza. Limpie la oblea de silicio manualmente con isopropanol y pelusa.Nota: Para la proyección de imagen correlativa utilice óxido de estaño indio (ITO)-recubiertas de vidrio cubreobjetos. Debe manejarse con mucho cuidado y limpieza extra no es necesario. Fijar el sustrato a un extremo de la placa portadora con un adhesivo removible.Nota: Como alternativa, los bordes del sustrato pueden ser inmovilizados paralelo al filo de la navaja con dos bandas de cinta adhesiva. Plasma Active (descarga del resplandor) el sustrato con aire para obtener una superficie hidrofílica. Esto debe hacerse de tal manera que una gota de agua se coloca sobre el sustrato se extiende a una capa muy delgada (ángulo de contacto baja, figura 2, D). Hydrophilization parámetros dependen del dispositivo usado; para los parámetros utilizados aquí, consulte la Tabla de materiales.Nota: Activación de Plasma es muy volátil, así que realizar este inmediatamente antes del uso del sustrato. Introduzca el portador en la abrazadera de un soporte de sustrato, con el sustrato montado más cerca para el filo de la navaja para lograr la óptima adherencia de soldadura del sustrato en el barco de cuchillo.Nota: Una descripción detallada de la titular de sustrato, incluyendo los dibujos de diseño asistido por ordenador (CAD), se da en Wacker et al. 11 Preparación de seccionamiento Inserte un cuchillo del diamante enorme soporte de la cuchilla, ajuste el ángulo de separación (a 0° para cuchillo Jumbo) y llenar el barco de cuchillo con agua destilada. Enfoque el cuchillo a una distancia de 1-2 mm a la muestra. Baje el sustrato en el agua usando tornillos de 1-3 (figura 2A) del soporte del sustrato. Compruebe que la línea de flotación está situado en el tercio superior del sustrato.Nota: Compruebe que el pegamento entre el sustrato y portador de la placa es bien curado por empujar el sustrato con pinzas limpias. No debe moverse. Porque es difícil ver la distancia al suelo cuando se utiliza una oblea de silicio, baje el sustrato hasta que sienta que toquen el suelo. Ahora Levante el sustrato un poco. Asegúrese de que el sustrato ni el portador toca el barco de la cuchilla durante el corte. Utilice una jeringa o pipeta para ajustar el nivel del agua en el barco. Mirando por los binoculares, agregar o quitar el agua hasta que el área completo de la superficie del agua muestra una reflexión homogénea de la iluminación de la luz superior de la ultramicrotomía. Encender la luz inferior de la ultramicrotomía. Asegúrese que el brazo esté en la posición intermedia y no en Contracción mediante el volante de la ultramicrotomía. Enfoque el cuchillo a la muestra hasta que el reflejo del filo de la navaja es visible en la cara del bloque. Utilice las opciones de ajuste de la ultramicrotomía para alinear la muestra para el cuchillo. En primer lugar girar el cuchillo, luego gire e incline la muestra.Nota: Se alinea correctamente si la franja de luz, que puede verse en la diferencia entre la muestra y el cuchillo, muestra aristas paralelas (rectas paralelas y no en forma de cuña). Compruebe la inclinación de la muestra: Asegúrese de que la franja de luz no es más gruesa o más delgado mientras se mueve hacia arriba y hacia abajo la muestra. Si es necesario, utilice el tornillo de ajuste del arco para corregir esto. Mover la cuchilla más cercano a la muestra hasta que está justo encima de la cara de bloque (pero sin tocarlo). Ajuste grueso de la sección (alimentación), corte de velocidad y ventana de corte en la unidad de control. Iniciar sección. Si es necesario, espere a que la primera sección completa se está cortando. Cortar algunas secciones para asegurarse que peguen a cintas de forma (de lo contrario el pegamento debe aplicarse otra vez). Empezar con un alimento de alto valor (máximo 200 nm para el cuchillo Ultra) hasta que se corte la primera sección completa. A continuación, establezca el valor deseado de la alimentación. Para la estabilidad de la cinta adecuada, un espesor de sección de 100 nm y una velocidad de corte de 1 mm/s es un buen punto de partida. El menor espesor de sección alcanzables es alrededor de 60 nm, dependiendo de la calidad de la muestra. Deje de seccionamiento. Uso de pelo de un gato de la pestaña de barcos y elimine todas las secciones (cortadas parcial) innecesarias desde el filo de la navaja. Si hay muchos pequeños escombros flotando alrededor, quitar el agua con una pipeta y llenar el bote con agua fresca. Ahora el proceso está listo para la primera cinta productiva. De seccionamiento Iniciar sección. Una vez que se ha cortado varias secciones (el número depende del tamaño de las secciones y el substrato), detener el proceso de seccionamiento y suelte la cinta desde el filo de la navaja por acariciando suavemente sobre el filo de la navaja con una pestaña14 o mejor aún, con una muy pelo suave de la piel de un gato. Manipular (vaivén) la cinta con la pestaña hacia el sustrato y la primera sección en el sustrato.Nota: Es necesario empujar suavemente la cinta hasta que se pega a la parte seca del sustrato. Continuar seccionamiento y colocar las cintas al sustrato. Empezar en un lado y poco a poco más hacia el otro con cada nueva cinta.Nota: Evitar movimientos del agua enorme para evitar aflojar las cintas ya adjuntas. Lo mismo vale para las corrientes de aire. Utilice el protector de respiración con el ultramicrótomo. En condiciones ambientales desfavorables, un recinto para la ultramicrotomía se recomienda15. Cuando el sustrato está completamente forrado con cintas (generalmente 4-5 cintas son factibles), suavemente Levante-hacia fuera el sustrato desde el barco de cuchillo con los tornillos micromanipulador del soporte del sustrato.Nota: Los movimientos convenientes son: levantar verticalmente (tornillo 1) y rotación e inclinación (tornillo 3), o una combinación de ambos. Deje que se seque antes de guardarlo en un ambiente libre de polvo la matriz de cinta. Después de secar, quitar el sustrato adhesivo de montado tan pronto como sea posible de la compañía (en el mismo día, si no el substrato puede ser difícil de quitar o incluso se puede romper durante el desmontaje). 2. tinción para la proyección de imagen de LM Nota: Diferentes métodos de tinción/etiquetado son posibles, incluyendo protocolos de inmunofluorescencia. Aquí una mancha directa, más bien inespecífica es elegida para delinear las paredes celulares. Tinción de yoduro de propidio Cubrir el fondo de un vaso grande de Petri (30 cm de diámetro) con parafilm y la línea del borde del plato con tejido mojado para crear una cámara húmeda. Utilice aproximadamente 300-500 μl de solución por cubreobjetos. Coloque una gota de cada cubreobjetos en el parafilm y poner el vaso boca abajo en la gota, para que las secciones están en contacto con el líquido de tinción. Cubrir el plato y envolver con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz. Incubar las muestras durante 16 horas a 4 ° C. Quite el cubreobjetos con pinzas y lavarlo moviéndolo arriba y abajo en un vaso de precipitados de 100 mL con 80 mL de agua destilada. Repita este paso en otro vaso de precipitados con agua fresca. Seque el cubreobjetos cuidadosamente con aire comprimido. 3. la pila de imágenes de la grabación en la FLM Coloque el cubreobjetos en el escenario de un FLM gran campo común. Elija el conjunto de filtro apropiado (Tabla de materiales) para que la fluorescencia que se observarán. Con un objetivo conveniente, tomar una imagen del objeto en cada sección: tratar de llenar el campo de visión y mantener la orientación constante. Para la punta de la raíz, se utilizó el objetivo 40 X aire.Nota: Si las cintas no son perfectamente rectas, un escenario giratorio puede ayudar a reorientar las secciones mientras esté tomando imágenes. Si es posible, centrar la imagen en una característica específica o mantener una característica como el borde de la sección a la misma distancia al borde de la imagen grabada. Si es posible, utilizar 16 bits para limitar pixeles saturados y mantener constante el tiempo de exposición. 4. el registro de la pila de la imagen FLM Importar la imagen de la serie en Fiji16 como una pila virtual. Abra un nuevo TrakEM17 (en blanco) desde el menú archivo. Haga clic derecho en el campo de la imagen e importar la pila en TrakEM como “Una rebanada por capa”. Alinear capas (click derecho en el campo de la imagen), el rango (imagen primero al último) y elija ninguno como referencia. Para todos los ajustes, utilice los valores predeterminados y elija rígido como la transformación deseada. Cuando el registro está terminado y satisfactorio, excepto el conjunto de datos alineado por clic derecho y elija Exportar. Imagen plana, establecer el intervalo de la primera a la última imagen y deje que el software muestre la pila resultante. Guarde la pila en formato tif. 5. tinción y montaje para la proyección de imagen de SEM Nota: Para la preparación de soluciones de tinción véase Tabla de materiales. Soluciones pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta por 12 meses, protegido de la luz y el aire. PRECAUCIÓN: Citrato y uranilo acetato de plomo contienen metales pesados que son tóxicos. Utilice guantes y desechar los residuos de acuerdo con las instrucciones de las autoridades locales. Cubrir el fondo de un vaso grande de Petri (30 cm de diámetro) con parafilm y la línea del borde del plato con tejido mojado para crear una cámara húmeda.Nota: Es importante que varias pastillas de NaOH se colocan dentro de la caja Petri cerca de las gotas de tinción para prevenir la precipitación excesiva de citrato de plomo. Tinción de acetato de uranilo Centrifugue la solución de acetato de uranilo a 2.680 x g durante unos segundos a las pequeñas partículas de sedimento. Utilice aproximadamente 300 – 500 μl de solución por cubreobjetos. Coloque una gota de cada cubreobjetos en el parafilm y poner el vaso boca abajo en la gota, para que las secciones están en contacto con el líquido de tinción. Incubar 10 min a temperatura ambiente y cubrir el plato durante la coloración. Quite el cubreobjetos con pinzas y colada moviendo hacia arriba y hacia abajo en un vaso de precipitados lleno de agua destilada (ver paso 2.1.3). Provocar manchas de citrato Durante la incubación de acetato de uranilo, preparar la solución de citrato de plomo.Nota: Citrato de plomo siempre debe filtrarse inmediatamente antes del uso para quitar cualquier precipitados. También centrifugar la solución de citrato de plomo a 2.680 x g durante unos segundos como en el paso 5.2.1. Utilice aproximadamente 300 – 500 μl de solución por cubreobjetos. Coloque una gota para cada cubreobjetos en el parafilm inmediatamente antes de lavar los cubreobjetos después de la tinción de acetato de uranilo y poner el vaso boca abajo en la gota, para que las secciones están en contacto con el líquido de tinción. Coloque las gotas (300 – 500 μl) en el parafilm inmediatamente antes de lavar los cubreobjetos después de la tinción de acetato de uranilo.Nota: Para evitar la formación de precipitados, no respirar sobre las gotas de citrato de plomo. Coloque el cubreobjetos lavado boca abajo sobre la gota (no es necesario secarla). Incubar por 5 min a temperatura ambiente y cubrir el plato durante la tinción. Quite el cubreobjetos con pinzas y lavarlo como se describió anteriormente en un vaso con agua (paso 5.2.4). Seque el cubreobjetos cuidadosamente con aire comprimido. Montaje de las muestras para la proyección de imagen de SEM Monte las obleas de silicio en los talones de aluminio con una almohadilla adhesiva carbono.Nota: Cubreobjetos recubierto ITO pueden o bien montarse mediante pintura de plata y cinta de Cu, asegúrese de que la superficie del conductor está conectada a la evacuación, o con pastillas de carbón que el anterior. En ese caso, es posible una Unión de la superficie de ITO para el talón con una gota de pintura de plata. 6. proyección de imagen en el SEM jerárquica Nota: En una emisión de campo SEM, elegir una energía primaria baja (3 kV o menor), una viga actual en un rango de 50 a 800 pA para evitar la carga y una distancia de trabajo adecuada para la recolección eficiente de electrones secundarios o back-esparcidas. Selección de la corriente de la viga depende de las propiedades de la muestra (por ej., incrustación de resina); la dosis de electrones también será un compromiso entre una pequeña corriente (menos perjudicial para la muestra) y una corriente alta, que es beneficioso para la velocidad de la proyección de imagen y por lo tanto disminuye el tiempo de adquisición de imagen total. Detectores de dedicado para los electrones detrás-dispersados proporcionan buen contraste, son menos sensibles a la carga de la muestra y ver menos de artefactos de superficie de la muestra (pliegues, marcas de cuchillo). Brillo y contraste deben ajustarse tales que el histograma esté centrado. Proyección de imagen de SEM En primer lugar definir las cuatro esquinas de la matriz por el acaparamiento de una imagen de cada esquina en la ampliación baja, de 100 x. Crear una región de interés (ROI) que encierra la matriz entera. Asignar un imagen protocolo con los siguientes parámetros: un detector de electrones secundarios (SE), que permite la proyección de imagen de alta velocidad en un tamaño de píxel de imagen grande (por ejemplo 1.000 nm) y en un tiempo corto (por ejemplo, 0,2 μs).Nota: Para superar las limitaciones ópticas electrones en un gran análisis campos de vista (FOV), que podría dar lugar a distorsiones en la periferia de las imágenes, usar modos de ampliación baja dedicada (proporcionados por la mayoría de los fabricantes SEM) o medio, campos de exploración de 1 a 2 k para imágenes individuales. Generar una sección mediante la creación de un ROI que sólo el tejido en la primera sección. Clonar a todas las secciones posteriores utilizando la herramienta Tampón. Gire el ROIs cuando sea necesario para acomodar las cintas dobladas. Grabar la serie de imagen con un tamaño de píxeles intermedios (alrededor de 50 nm) y una permanencia de tiempo el tiempo suficiente para identificar y reconocer la estructura diana. Utilizar un campo de visión de imágenes individuales en un rango de 6-10 k píxeles.Nota: El software Atlas 5 puede recopilar automáticamente mosaicos compuesto por imágenes adyacentes para cubrir áreas grandes de ROI de sección a través de las secciones seriadas. Crear un sitio dentro de este conjunto de sección, que contiene la estructura de destino para la proyección de imagen de mayor resolución SEM. Realizar el retorno de la inversión bastante grande en cuenta para la precisión de la etapa. Comprobar y ajustar las posiciones de los sitios.Nota: Es importante colocar el ROIs de tal manera que el centro, donde se realizará el autofocus y autostigmation, no se siente “vacío” material con ningún detalle estructural, por ejemplo., vacuolas. Definir los ajustes de enfoque automático y comprobar el rendimiento al menos la longitud de una cinta (es decir, la distancia más larga que la etapa tiene para viajar) en un pequeño ROI cerca del sitio que será fotografiado. Definir un protocolo para la adquisición de SEM de alta resolución de imagen. Ver compartimentos de membrana, elegir tamaño de pixel de imagen de 3 a 5 nm. Seleccione un tiempo de permanencia según el detector de modo que la imagen no es muy ruidosa. Antes de iniciar la adquisición, definir los valores de foco en por lo menos la primera sección de cada cinta utilizando la opción de protocolo de verificación. La proyección de imagen automatizada de SEM a empezar toda la serie de destino ROIs. Exportar los datos adquiridos como serie de imagen, preferiblemente en formato tif. 7. el registro de la pila de la imagen de SEM Importar imagen de la serie en Fiji como una pila virtual.Nota: Estos serán grandes archivos de datos en la gama de pocos GB dependiendo el número de secciones y el tamaño del ROI. Cultivo la imagen SEM del apilado para su posterior procesamiento en un área tan cerca de la estructura de interés posible y ajustar el brillo y contraste. Abra un nuevo TrakEM17 (en blanco) desde el menú archivo. Haga clic derecho en el campo de la imagen e importar la pila en TrakEM como “Una rebanada por capa”. Alinee las capas (click derecho en el campo de la imagen), elige mínimos cuadrados como modo, establecer el intervalo (primera imagen a la última) y elija ninguno como referencia. Para la configuración, utilice los valores predeterminados y elija rígido como la transformación deseada. Cuando el registro es completa y satisfactoria, excepto el conjunto de datos alineado por haga clic derecho y seleccione Exportar. Hacer una imagen plana, establecer el intervalo de la primera a la última imagen y deje que el software muestre la pila resultante. Guarde la pila en formato tif.