פרוטוקול זה מטרות תאים ספציפיים ברקמות עבור הדמיה ברזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תחילה עם תמונה של מספר גדול של טורי מקטעים של שרף-מוטבע בחומר ביולוגי במיקרוסקופ אור כדי לזהות את המטרה ולאחר מכן באופן היררכי ב- SEM.
פילוח תאים ספציפיים ברזולוציה ultrastructural בתוך אוכלוסיה לתא מעורב או רקמה יכולה להיות מושגת על ידי הדמיה היררכי באמצעות שילוב של אור ואלקטרון. דוגמאות נעוץ שרף למחלקה לתוך מערכי המורכב סרטים של מאות סעיפים ודק במיוחד, שהופקדו על חתיכות של פרוסות סיליקון או coverslips מצופה conductively. מערכים הם עם תמונה ברזולוציה נמוכה באמצעות הצרכן הדיגיטלי החכם מצלמה, בסיוע מיקרוסקופ אור (LM) עבור סקירה מהירה שטח גדול, או מיקרוסקופ פלורסצנטיות שדה רחב (קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ אור (הצילומים)) לאחר תיוג עם fluorophores. לאחר פוסט-צביעת מתכות כבדות, מערכים הם צילמו במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). הבחירה של מטרות אפשרי שחזורים תלת-ממד שנוצר על ידי הצילומים או שחזורים תלת-ממד מסיבים של אוספי תמונות SEM ברזולוציה ביניים אם אין סמני פלורסנט זמינים. ניתוח ultrastructural, יעדים נבחרים נרשמים לבסוף בעוד SEM ברזולוציה (כמה ננומטר פיקסלים בתמונה). כלי טיפול רצועת הכלים יכולה שרשומים על כל ultramicrotome הוא הפגין. היא מסייעת עם מערך ייצור המצע להסרת מהסירה הסכין אופטים. נדון פלטפורמת תוכנה המאפשרת הדמיה אוטומטית של מערכים ב- SEM. לעומת שיטות אחרות ליצירת נפח גדול EM נתונים, כגון לחסום טורי-פרצוף SEM (SBF-SEM) או יון ממוקדת קרן SEM (שיקרתי-SEM), גישה זו יש שני יתרונות חשובים: (1) חוק המדגם שרף-מוטבע, אם כי בגרסה פרוסים-up. זה יכול להיות מוכתם בדרכים שונות, עם תמונה עם רזולוציות שונות. (2) כפי הסעיפים יכול להיות מוכתם פוסט, אין צורך להשתמש דגימות שהוכתמו בלוק בחוזקה מתכות כבדות כדי להציג את הניגודיות עבור הדמיה SEM או למסור את הרקמה בלוקים מוליך. זה הופך את השיטה החלים על מגוון רחב של חומרים, השאלות הביולוגיות. חומרים במיוחד כנסיעה למשל, בנקים ביופסיה, מעבדות פתולוגיות, יכול להיות מוטבע באופן ישיר משוחזר ב- 3D.
לשחזור כמויות גדולות של רקמות ברזולוציה ultrastructural מספר גישות הדמיה שונות בהתבסס על SEM היה בשימוש1: מקיף הדעת הינם זמינים למשל., SBF-SEM2, שיקרתי-SEM3של מערך טומוגרפיה (ב)4. בזמן עבור פעולת השירות השנייה דגימת החומר נשמר כמערך של מקטעים טורית על מצע, SBF-SEM, שיקרתי-SEM הם שיטות הרסני, עובד על הרחוב דגימה לצרוך אותו במהלך דימות. עקב ההטענה של השרף בעוד SEM, הם גם תלוי מדגם מחלקמסוים חריפה בלוקים5.
מצד שני, זיהוי תאים או מבנים של עניין בתוך דגימת רקמה מסוימים יכולים להרוויח במיוחד אור correlative ומיקרוסקופ אלקטרונים (קלם)6,7,8. באמצעות הצילומים עבור מיקוד מונע את היישום של כמויות גדולות של מתכת כבדה מאז זה להרוות את האות של קרינה פלואורסצנטית9. לקבלת דוגמאות מחלקמסוים מעט, רק כאלה AT היא שיטת הבחירה מכיוון במערכים ייתכן שלאחר ויטראז’ים עם מטאל בקלות לאחר LM הדמיה. יתר על כן, כמעט כל סוג הדגימה עשוי לשמש AT, אפילו שגרתית דגימות של הפתולוג אוצר החזה10.
יתרון גדול נוסף של AT הוא הפוטנציאל הירארכי11 או הדמיה ברזולוציה מרובה12: זה לא הכרחי כדי התמונה הכל ברזולוציה, כמו מטרות שייתכן שייבחר מודאליות שונים (למשל, הצילומים) או ב תמונות SEM ברזולוציה נמוכה. הדמיה רק את האזורים מעניין של אוכלוסיה רקמות או תא ברזולוציה חוסכת שטח אחסון נתונים דיגיטליים ומייצרת קטנים יותר ערכות נתונים תמונה, אשר קל יותר להתמודד. כאן, שזרימת העבודה AT הוכח באמצעות דגימת די חלש מחלקמסוים: בלחץ גבוה קפוא שורשי צמחים (תודרנית לבנה) המוטבעות שרף הידרופילית.
כיצד מערכי מוכן, צבעונית, עם תמונה הצילומים והן SEM, וכיצד אוספי תמונות רשומים מוסברים. כמו כן, כיצד ניתן להשתמש על שחזור תלת-ממד של אמצעי האחסון הצילומים כדי לבחור תאים ספציפיים עבור הדמיה SEM ברזולוציה הננומטרי מודגם.
זרימת עבודה עבור מיקוד תאים ספציפיים בתוך רקמה על ידי AT הירארכי ומשולבות הודגם: מדגם שרף-מוטבע הוא חילקו לתוך מערכים של מקטעים סדרתי, אשר ממוקמות על מצע מוליך באמצעות בעל המצע אישית מעוצבת. לאחר תיוג עם fluorophore דימות in בסוף הצילומים, האחסון ששוחזר משמש לבחירת תאי היעד. לאחר צביעת נוספים סיבובים עם מתכות כבדות להציג ניגודיות, היעדים הללו הם צילמו לאורך מספר איזורים מאות ברזולוציה הננומטרי בעוד SEM באמצעות פלטפורמת תוכנה אוטומטיות.
להפקת מערכים בצפיפות עם מספר סרטים ארוכים, בעל מצע דומה לזו המתוארת כאן היא הכרחית. אדם מיומן וסבלני תוכל לצרף מספר סרטים מצע הסיליקון, שקוע למחצה סירה הסכין, ולאחזר את המערך על-ידי בהדרגה הנמכת מפלס המים עד הסרטים יושבים על המצע. עם זאת, לנוכח הניסיון שלנו, יש נטייה לנפץ היווצרות כאשר המצע נוגעת בכל חלק של הסירה את הסכין (cf. שים לב ב 1.3.2 בפרוטוקול). בנוסף, ההליך זה הרבה יותר קשה עם מצעים מצופים איטו: (1) בשל השקיפות של הזכוכית איטו, קשה לראות את הקצה של המים שבו הקצוות של הסרטים צריך להיות מחובר; 2) בגלל פני השטח מצופים איטו היא הרבה יותר קשה מאשר פרוסות הסיליקון המבריקה, הסרטים נוטים לשבור במהלך מעלית ו שברים קטנים יותר בהיקף של כמה חלקים עשויים לצוף, ובכך להרוס את סדר המקטעים.
כל זרימת העבודה היא גם אפשרית ללא מתאם הצילומים נתונים. במקרה זה, של ה-SEM איסוף נתונים, ייתכן שיהיה עליך להתבצע תוך מספר מפגשים. באמצעות עבודות שיקום 3D הראשונית או לפחות הערכה של נתונים ברזולוציה נמוכה או בינונית עשוי להיות נחוץ לזהות מטרות. בנוסף, ניתן להחיל קונבנציונאלי היסטולוגית כתמים על brightfield LM (לא דרישת הצילומים). כמובן, אחרים אפשרויות6,7,8 הם נוגדנים תיוג על המערכים, כפי שהוכח כבר בעיתון הראשונית על18, או גנטית המקודדים חלבונים פלורסנט (XFPs) או טרום הטבעה תיוג עם שימור פלורסצנטיות במהלך הכנת הדוגמא.
מגבלה כללית של השיטה דנו הוא השימוש של מקטעים של עובי מסוים ואת הדוגמאות דיסקרטית וכתוצאה מכך של הגוף התלת-ממדי: רזולוציה ב- Z רק יכול להיות טוב כמו העובי של הסעיפים מאז ה-SEM אוספת נתונים רק מפני השטח בסעיף (ד epending על האנרגיה האנרגיה העיקרי/הנחיתה שנבחרו). משמעות הדבר היא כי הגוף התלת-ממדי וכתוצאה מכך יש voxels אנאיזוטרופי, למשל., 5 x 5 x 100 ננומטר3 אם 100 ננומטר ומקטעים גודל פיקסל תמונה של 5 nm משמשים. עבור ישויות קטן מאוד בטווח גודל מתחת 1 מיקרומטר, לא ייתכן מספיק לתיאור ultrastructural אמיתי. מגבלה טכנית יותר הוא הדיוק של השלב בשימוש ה-SEM אוטומטיות הדמיה. בגלל זה, יש צורך לבחור רועי גדול יותר המפרטים של דיוק הבמה כדי להבטיח כי הוא עם תמונה של אזור היעד מלא.
לעומת SBF-SEM, שיקרתי-SEM כמו בשיטות הדמיה בלוק-פרצוף, correlative AT יש החיסרון סופית של voxels אנאיזוטרופי, כמפורט לעיל. עם שיקרתי-SEM, איזוטרופיות voxels של 5 x 5 x 5 nm3 ניתן להשיג כאשר תיקון להיסחף נכונה במקום.
פערים האחסון המשוחזרת עקב אובדן חלקים במהלך הכנת מערכי ייתכן גם חשש כי הוא לא נתקל עם SBF-SEM או שיקרתי-ב-SEM. עם סרט טוב ייצוב על ידי דבק, זה בדרך כלל רק עניין עבור המקטע האחרון של סרט: שהוא ניזוק בעת שחרור אותו מן הכי קשה באמצעות את הריס. עם זאת, מניסיוננו, האובדן של מקטע אחד בסעיפים 20 – 50 כל לא להשפיע התמונה רישום.
מצד שני, האפשרות שלאחר כתם מערכים מקנה איתות טוב והחדות עבור הדמיה SEM, אפילו על דגימות בחולשה מחלקמסוים כגון לחץ גבוה קפוא טיפים שורש המוצג כאן. לכן, אין צורך להתפשר אופטימלית שימור ultrastructural על ידי רבים קיבוע כימי והשלבים metallization. כמו כן, שגרתית דגימות למעבדה פתולוגיה עם דרגות ביניים של metallization מספקים נתונים מצוינים10. כזה שיפור חדות לאחר ההטבעה אינה אפשרית עבור SBF-SEM, שיקרתי-SEM באופן כללי. יתר על כן, מאז שיטות אלה הם הרסניים, קרי, לצרוך את הדגימה במהלך ההדמיה, הירארכי הדמיה ב רזולוציות שונות ואתרים או הדמיה חוזר ונשנה בשלבים מאוחרים יותר בזמן בלתי אפשרי. בעקרון, אמצעי אחסון ללא הגבלה, המורכב FOVs גדולים (למשל, עד כמה מילימטרים עבור מוח העכבר כל ב- connectomics) נוצר על ידי תפרים פסיפסים, מספרים עצומים של מקטעים ניתן לרכוש באמצעות AT, בעוד שיקרתי-SEM, FOVs מעבר 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר הם קשים להשגה עם מכשירים שגרתי.
אוטומציה נוספת של AT-זרימת העבודה המתוארת יהיה יתרון מובהק, מאחר השיטות הנ ל SBF-SEM, שיקרתי-SEM לבצע חלוקתה והן הדמיה בתוך מכשיר זהה באופן אוטומטי לחלוטין. קיים סוג אחד של אוטומציה של חלוקתה: ATUMtome12 יכול לייצר ולאסוף אלפי סעיפים, אבל השימוש Kapton סרט כמו מצע עושה כאלה מערכים קשה התמונה הצילומים. על coverslips מצופים איטו המשמש כאן, הדמיה סופר-ברזולוציה אפילו צריך להיות אפשרי. מטרה נוספת, רצוי מאוד לאוטומציה תהיה ההקלטה של אוספים נתונים הצילומים. מצד שני, אוטומציה יכול להיות יקר וכן למעט המחזיק המצע, זרימת העבודה המוצגת כאן (מבחינת חומרה) רק על מכשור ניתן בדרך כלל במתקן שגרתית EM מעבדה או ליבה, שהופך אותו נמוך רמת גישה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי גרנט 13GW0044 FKZ מהמשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר, פרוייקט MorphiQuant-3D. אנו מודים ברטל קרולין לקבלת תמיכה טכנית.
Instrumentation | |||
Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sectioning | |||
Razor blades | Plano | T585-V | |
Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
Diamond scriber | Plano | T5448 | |
Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
Brush | Selfmade | ||
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
NaOH pellets | Merck | 106469 | |
1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mounting | |||
Stubs | Plano | G301F | |
Carbon pads | Plano | G3347 | |
Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions/mixtures | |||
Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
||
Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
||
Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |