Imaging multimodale gerarchica delle sezioni di serie per l'individuazione di specifici obiettivi cellulari all'interno di grandi volumi

Nota: Blocchi campione dovrebbero essere polimerizzati e contengono alcuni metalli pesanti. Fissazione e l’incorporamento di protocolli per i due campioni, mostrati in Figura 1A-B sono stati descritti altrove11. In breve, l’esempio mostrato in Figura 1A è stato fissato chimicamente, macchiato del blocco dell’en prima con OsO 1%4, quindi con 1% di acetato di uranile e incorporati in resina di Spurr. L’esempio mostrato in Figura 1B è stato congelato ad alta pressione, congelare sostituito con acetato di uranile 0,4% in acetone e incorporati in resina Lowicryl HM20. Utilizzare guanti senza polvere per le operazioni di preparazione successiva. 1. creazione di Array Taglio del blocco campioneNota: Serrare sempre bene durante l’inserimento di parti. Inserire il blocco porta-campione il portacampioni dell’ultramicrotomo, posizionare il supporto nel blocco di taglio e farlo slittare il livello più basso dell’ultramicrotomo. Tagliare via resina intorno al tessuto incorporato con una lama di rasoio lasciando solo un piccolo bordo di resina intorno al campione. Tagliare dalla parte superiore fino a raggiungere il target.Nota: La forma del blocco-viso può essere rettangolare o trapezoidale (abbiamo utilizzato con successo entrambe le forme). È importante utilizzare i lati più lunghi del rettangolo come il leader e il bordo finale per assicurare che una vasta area è coperta da miscela colla stabilizzando i nastri. Inserire il supporto del campione nel braccio dell’ultramicrotomo e sostituire il blocco di taglio nella fase inferiore del portalama. Inserire un coltello di taglio di diamante (normalmente 45°), il portalama. Allineare il blocco-faccia esattamente parallela al bordo di taglio coltello.Nota: Per produrre esattamente parallelo iniziali (in basso) e finali i margini (superiore), ruotare o spostare solo il coltello per tagliare i lati opposti. Per grandi volumi (più di parecchie centinaia sezioni), un coltello di taglio di 90° è vantaggioso. Lisciare tutti e quattro i lati, quindi ruotare il supporto del campione in modo che i leader e il bordo d’uscita sono ora in posizione orizzontale. Cappotto con attenzione i lati iniziali e finali del blocco con miscela adesiva. Utilizzare un pennello piccolo, formato da pochi peli fissati a un stuzzicadenti13. Eseguire questo passaggio rapidamente perché il solvente di questa miscela evapora in pochi secondi. Non contaminare il blocco-viso con questa miscela. Asciugare il blocco campione rivestito per 5-10 min.Nota: per un più grande numero di sezioni (> 200), potrebbe essere meglio rivestire il bordo solo, perché con il tempo, un rigonfiamento di colla potrebbe costruire sul bordo d’uscita e potenzialmente tirare indietro sezioni sopra il filo del rasoio. Preparazione del substrato Tagliare pezzi di wafer di silicio a una dimensione che si adatta in barca coltello (circa 2 x 2,5 cm2 per il coltello Jumbo). Se necessario, contrassegnare i pezzi di wafer (numeri o lettere) con uno scriber diamante prima di pulire o con pennarello indelebile dopo la pulizia. Pulire la lastra di silicio manualmente con isopropanolo e salvietta.Nota: Per formazione immagine correlativa utilizzare ossido di indio-stagno (ITO)-rivestito vetrini coprioggetti. Essi devono essere maneggiati con cura e pulizia supplementare non è necessaria. Difficoltà il substrato ad una estremità della placca utilizzando un adesivo rimovibile.Nota: In alternativa, i bordi del substrato possono essere appuntati paralleli il filo del rasoio utilizzando due strisce di nastro adesivo verso il basso. Al plasma attivare (Scarica a bagliore) il substrato con aria per ottenere una superficie idrofila. Questo dovrebbe essere fatto in modo che una goccia d’acqua inserito i substrato si diffonde in un film molto sottile (basso angolo di contatto, Figura 2, D). I parametri idrofilizzazione dipendono dal dispositivo al plasma utilizzato; per i parametri utilizzati qui, Vedi Tabella materiali.Nota: L’attivazione del Plasma è molto volatile, quindi eseguire questo immediatamente prima dell’uso di substrato. Inserire il supporto nel morsetto di un titolare di substrato, con il substrato montato più vicino per il filo del rasoio per raggiungere ottimale bagnabilità del substrato sulla barca di coltello.Nota: Una descrizione dettagliata del proprietario del substrato, compresi i disegni di progettazione assistita da elaboratore (CAD), è data in Wacker et al. 11 Preparazione di sezionamento Inserire una lama di diamante Jumbo del portalama, impostare l’angolo di spoglia (0° per coltello Jumbo) e riempire la barca di coltello con acqua distillata. Il coltello di approccio ad una distanza di 1 – 2 mm al campione. Abbassare il substrato in acqua tramite viti 1 – 3 (Figura 2A) del proprietario del substrato. Controllare che la linea di galleggiamento si trova nel terzo superiore del substrato.Nota: Controllare che la colla tra il substrato e portante la piastra è molto curata da spingendo il substrato con una pinza pulita. Non deve muoversi. Perché è difficile vedere l’altezza da terra quando si utilizza un wafer di silicio, abbassare il substrato fino a che si toccano il pavimento. Ora alza il substrato una piccola quantità. Assicurarsi che il substrato né il vettore tocca la barca di lama durante il taglio. Utilizzare una siringa o una pipetta per regolare il livello dell’acqua nella barca. Mentre si guarda attraverso il binocolo, aggiungere o rimuovere l’acqua fino a quando l’intera area della superficie dell’acqua presenta una riflessione omogenea della luce illuminazione superiore dell’ultramicrotomo. Accendere la luce di fondo dell’ultramicrotomo. Assicurarsi che il braccio è in posizione centrale e non in ritrazione utilizzando la rotella di mano dell’ultramicrotomo. Approccio il coltello al campione fino a quando il riflesso del del coltello è visibile sulla faccia del blocco. Utilizzare le opzioni di regolazione dell’ultramicrotomo per allineare il campione al coltello. Prima di ruotare il coltello, poi ruotare e inclinare il campione.Nota: È allineato correttamente se la striscia di luce, che può essere visto nel divario tra il campione e il coltello, Mostra bordi paralleli (linee parallele dritto e non a forma di Cuneo). Controllare l’inclinazione del campione: assicurarsi che la striscia di luce non diventa più spessa o più sottili, mentre il campione in movimento su e giù. Se necessario, è possibile utilizzare la vite di regolazione ad arco per risolvere il problema. Spostare il coltello più vicino al campione fino a quando è appena sopra la faccia di blocco (ma non lo tocchi). Impostare lo spessore di sezione (feed), taglio di velocità e la finestra di taglio presso l’unità di controllo. Avviare il sezionamento. Se necessario, attendere fino a quando la prima sezione completa viene tagliata. Tagliare alcune sezioni per essere sicuri che si attaccano insieme ai nastri di forma (altrimenti la colla deve essere applicato nuovamente). Iniziare con un alto valore di alimentazione (Max, 200 nm per il coltello Ultra) fino a quando la prima sezione completa viene tagliata. Quindi, impostare il valore desiderato di mangimi. Per stabilità adeguata nastro, uno spessore della sezione di 100 nm e una velocità di taglio di 1 mm/s è un buon punto di partenza. Lo spessore di sezione realizzabile più basso è di circa 60 nm, a seconda della qualità del campione. Smettere di sezionamento. Rimuovere tutte le sezioni (parzialmente tagliate) non necessari dal filo del rasoio e barca usando i capelli di un gatto/ciglia. Se c’è un sacco di piccoli detriti galleggianti intorno, rimuovere l’acqua completamente con una pipetta e riempire la barca con acqua fresca. Ora il processo è pronto per il primo fiocco produttivo. Sezionamento Avviare il sezionamento. Una volta che è stato tagliato un numero di sezioni (il numero effettivo dipende dalle dimensioni delle sezioni e substrato), interrompere il procedimento di taglio e rilasciare il nastro dal filo del rasoio accarezzando delicatamente sopra il filo del rasoio con un ciglio14 o meglio ancora, con un molto capelli morbidi da pelliccia di un gatto. Manipolare (push/pull) il nastro con le ciglia verso il substrato e fissare la prima sezione al substrato.Nota: È necessario spingere delicatamente il nastro finché non si attacca alla parte secca del substrato. Continuare sezionamento ed allegando i nastri al substrato. Incominciare da un lato e spostare gradualmente oltre a altro con ogni nuova barra multifunzione.Nota: Evitare movimenti massiccia dell’acqua per evitare l’allentamento i nastri già allegati. Lo stesso vale per correnti d’aria. Usare lo scudo di respiro consegnato con l’ultramicrotomo. In condizioni ambientali sfavorevoli, un recinto per l’ultramicrotomo è consigliato15. Quando il substrato è completamente coperto con i nastri (4 – 5 nastri sono solitamente fattibile), il substrato delicatamente alza-fuori dalla barca coltello usando le viti micromanipolatore del proprietario del substrato.Nota: I movimenti adatti sono: sollevare verticalmente (vite 1) e di rotazione/inclinazione (vite 3), o una combinazione di entrambi. Lasciate la matrice di nastro asciugare prima di riporlo in un ambiente privo di polvere. Dopo l’essiccazione, rimuovere l’adesivo substrato montato appena possibile da parte del vettore (sullo stesso giorno, altrimenti il substrato potrebbe essere troppo difficile da rimuovere o potrebbe persino rompere durante lo smontaggio). 2. colorazione per l’Imaging di LM Nota: Diversi metodi di colorazione/etichettatura sono possibili, inclusi i protocolli di immunofluorescenza. Qui un diretto, piuttosto aspecifiche macchia viene scelto per delineare le pareti cellulari. Ioduro di propidio Coprire il fondo di un bicchiere grande di Petri (diametro 30 cm) con parafilm e linea il bordo del piatto con tessuto bagnato per costruire una camera umida. Usare circa 300-500 µ l di soluzione al vetrino coprioggetti. Depositare una goccia per ogni vetrino coprioggetti sul parafilm e mettere sottosopra il vetro sulla goccia, in modo che le sezioni sono a contatto con il fluido di colorazione. Incoperchiare il recipiente e avvolgerlo con un foglio di alluminio per proteggere i campioni dalla luce. Incubare i campioni per 16 h a 4 ° C. Rimuovere il vetrino coprioggetto con le pinzette e lavarlo con un movimento su e giù in un becher da 100 mL riempito con 80 mL di acqua distillata. Ripetere questo passaggio in un altro becher con acqua fresca. Asciugare il vetrino coprioggetto accuratamente con aria compressa. 3. registrare la serie di immagini nella FLM Posto il coprioggetto sul palco di un comune FLM grandangolari. Scegliere il filtro appropriato set (Tabella materiali) per la fluorescenza devono essere rispettate. Con un obiettivo adatto, scattare una foto dell’oggetto in ogni sezione: cercare di riempire il campo di vista e mantenere costante l’orientamento. Per la punta della radice, è stato usato un obiettivo 40x aria.Nota: Se i nastri non sono perfettamente allineati, un palco rotante può aiutare a riorientare le sezioni durante l’assunzione di immagini. Se possibile, centrare l’immagine su una caratteristica specifica o mantenere una funzionalità come ad esempio il bordo della sezione ad una distanza uguale al bordo dell’immagine registrata. Se possibile, utilizzare 16 bit per limitare pixel saturi e mantenere costante il tempo di esposizione. 4. registrazione dello Stack immagine FLM Importare la serie di immagini in Fiji16 come uno stack virtuale. Aprire un nuovo TrakEM17 (vuota) dal menu file. Fare clic con il pulsante destro nel campo immagine e importare lo stack in TrakEM come “Una fetta per strato”. Allineare i livelli (click destro nel campo image), impostare l’intervallo (prima immagine all’ultimo) e scegliere nessuno come riferimento. Per tutte le impostazioni, utilizzare i valori predefiniti e scegliere rigida come la trasformazione desiderata. Quando la registrazione è finito e soddisfacente, Risparmia il dataset allineato da tasto destro del mouse e scegliere Esporta. Rendere l’immagine piatta, impostare l’intervallo dalla prima all’ultima immagine e lasciare che il software Visualizza lo stack risultante. Salvare lo stack in formato tif. 5. colorazione e montaggio per l’Imaging di SEM Nota: Per la preparazione delle soluzioni di colorazione Vedi Tabella materiali. Soluzioni possono essere conservati a 4 ° C fino a 12 mesi, protette dalla luce e aria. Attenzione: Acetato di piombo citrato e uranile contengono metalli pesanti tossici. Indossare guanti e smaltire i rifiuti secondo le istruzioni delle autorità locali. Coprire il fondo di un bicchiere grande di Petri (diametro 30 cm) con parafilm e linea il bordo del piatto con tessuto bagnato per costruire una camera umida.Nota: È importante che diversi pellet di NaOH sono posizionati all’interno di Petri vicino le gocce di colorazione per evitare eccessiva precipitazione di citrato di piombo. La macchiatura di acetato di uranile Centrifugare la soluzione di acetato di uranile a 2.680 x g per pochi secondi per piccole particelle di sedimento. Usare circa 300 – 500 µ l di soluzione al vetrino coprioggetti. Depositare una goccia per ogni vetrino coprioggetti sul parafilm e mettere sottosopra il vetro sulla goccia, in modo che le sezioni sono a contatto con il fluido di colorazione. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e coprire il piatto durante la colorazione. Rimuovi il coprioggetto con forcipe e lavare spostando su e giù in un bicchiere riempito con acqua distillata (Vedi punto 2.1.3). Piombo citrato macchiatura Durante l’incubazione di acetato di uranile, preparare la soluzione di citrato di piombo.Nota: Piombo citrato dovrebbe sempre essere filtrata immediatamente prima dell’uso per rimuovere eventuali precipitati. Anche Centrifugare la soluzione di citrato di piombo a 2.680 x g per pochi secondi come descritto al punto 5.2.1. Usare circa 300 – 500 µ l di soluzione al vetrino coprioggetti. Depositare una goccia per ogni vetrino coprioggetti sul parafilm immediatamente prima di lavare i vetrini coprioggetti dopo la macchiatura di acetato di uranile e mettere sottosopra il vetro sulla goccia, in modo che le sezioni sono a contatto con il fluido di colorazione. Posizionare le gocce (300 – 500 µ l) sul parafilm immediatamente prima di lavare i vetrini coprioggetti dopo la macchiatura di acetato di uranile.Nota: Per evitare la formazione di precipitati, non respirare sulle goccioline di citrato di piombo. Porre il coprivetrino lavato upside-down sul menu (non c’è nessun bisogno di asciugare). Incubare per 5 min a temperatura ambiente e coprire il piatto durante la colorazione. Rimuovere il vetrino coprioggetto con le pinzette e lavarlo come descritto in precedenza in un becher con acqua fresca (punto 5.2.4). Asciugare il vetrino coprioggetto accuratamente con aria compressa. Esempi di montaggio per l’imaging di SEM Montare i wafer di silicio su stub di alluminio con un pad di carbonio appiccicoso.Nota: Le lamelle rivestite con ITO possono essere montate utilizzando vernice argento e Cu-nastro — assicurarsi che la superficie conduttiva è collegata allo stub — o con pastiglie di carbonio come sopra. In tal caso, un collegamento conduttivo da ITO-superficie allo stub può essere fatto con una goccia di vernice argento. 6. gerarchico di formazione immagine nel SEM Nota: In un’emissione di campo SEM, scegliere un basso consumo energetico primario (3 kV o inferiore), un fascio di corrente in un intervallo da 50 a 800 pA per evitare di caricare e una distanza di lavoro adatto per efficiente raccolta di elettroni secondari e/o retro-sparsi. Selezione della larghezza corrente dipende dalle proprietà del campione (ad es., l’incorporamento di resina); la dose di elettrone sarà anche un compromesso tra una piccola corrente (meno dannosa per il campione) e a corrente forte, che è benefico per l’imaging di velocità e di conseguenza abbassa il tempo di acquisizione immagine totale. Dedicato rivelatori per elettroni sparsi schiena forniscano buon contrasto, sono meno sensibili alla carica del campione e mostrano meno di manufatti di superficie del campione (pieghe, segni di coltello). Contrasto e luminosità deve essere regolate in modo tale che l’istogramma è centrato. Formazione immagine di SEM Prima di definire i quattro angoli della matrice afferrando un’immagine di ogni angolo a basso ingrandimento, circa 100. Creare un’area di interesse (ROI) che racchiude l’intera matrice. Assegnare un protocollo di imaging con i seguenti parametri: utilizzare un rivelatore elettronico secondario (SE), che consente per immagini ad alta velocità a una dimensione di pixel di grande immagine (per esempio 1.000 nm) e un tempo di sosta breve (ad es., 0,2 µs).Nota: Per superare limiti ottici elettrone alle grandi scansione campi di vista (FOV), che potrebbe causare distorsioni alla periferia delle immagini, utilizzare modalità di ingrandimento basso dedicato (forniti dalla maggior parte dei produttori di SEM) o usare mezzo, campi 1 e 2 k scansione per singole immagini. Generare una sezione impostata creando un ROI che delinea solo il tessuto nella prima sezione. Clonarlo per tutte le sezioni successive utilizzando lo strumento timbro. Ruotare il ROIs quando necessario per ospitare nastri piegati. Registrare la serie di immagine utilizzando una dimensione di pixel intermedi (circa 50 nm) e una pausa di tempo abbastanza lungo per identificare e riconoscere la struttura di destinazione. Utilizzare un FOV per singole immagini in un intervallo di 6-10 k pixel.Nota: Il software Atlas 5 può raccogliere automaticamente mosaici composti da immagini adiacenti per coprire vaste aree ROI/sezione attraverso le sezioni seriali. Creare un sito situato all’interno di questo set di sezione, che contiene la struttura di destinazione per l’imaging ad alta risoluzione SEM superiore. Rendere il ROI abbastanza grande per tenere conto di precisione di fase. Controllare e regolare le posizioni dei siti.Nota: È importante posizionare il ROIs in modo tale che il centro, dove verrà eseguite la messa a fuoco automatica e autostigmation, non si siede sul materiale “vuoto” con nessun dettaglio strutturale, ad es., vacuoli. Definire le impostazioni di messa a fuoco automatica e controllare le prestazioni almeno la lunghezza di un nastro (cioè, la distanza più lunga che la fase deve viaggiare) su un piccolo ROI nei pressi del sito che verrà essere imaged. Definire un protocollo di imaging per l’acquisizione di SEM ad alta risoluzione. Per vedere i compartimenti di membrana, scegliere dimensione pixel immagine di 3 – 5 nm. Selezionare un tempo di sosta a seconda il rivelatore in modo che l’immagine non è troppo rumoroso. Prima di iniziare l’acquisizione, è possibile definire i valori di messa a fuoco su almeno la prima sezione di ogni nastro utilizzando l’opzione del protocollo di controllo. Ricominciare l’imaging automatici SEM tutta la serie di destinazione ROIs. Esportare i dati acquisiti come serie di immagini, preferibilmente in formato tif. 7. registrazione dello Stack immagine SEM Importazione di serie di immagini in Fiji come uno stack virtuale.Nota: Questi saranno i file di dati di grandi dimensioni nel range di pochi GB a seconda del numero di sezioni e la dimensione del ROI. Ritaglia l’immagine di SEM dello stack per l’ulteriore elaborazione in un’area più vicino la struttura di interesse possibile e regolare la luminosità e il contrasto. Aprire un nuovo TrakEM17 (vuota) dal menu file. Fare clic con il pulsante destro nel campo immagine e importare lo stack in TrakEM come “Una fetta per strato”. Allineare gli strati (click destro nel campo image), scegliere minimi quadrati come modalità, impostare l’intervallo (prima immagine all’ultimo) e scegliere nessuno come riferimento. Per le impostazioni, utilizzare i valori predefiniti e scegliere rigida come la trasformazione desiderata. Quando la registrazione è completata e soddisfacente, Risparmia il dataset allineato da tasto destro del mouse e scegliere Esporta. Rendere un’immagine piatta, impostare l’intervallo dalla prima all’ultima immagine e lasciare che il software Visualizza lo stack risultante. Salvare lo stack in formato tif.