Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes
Summary
Este protocolo visa células específicas no tecido para a imagem latente em nanoescala resolução usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Um grande número de seções seriais de resina-incorporado material biológico é primeiro fotografado em um microscópio de luz para identificar o alvo e então em uma maneira hierárquica na SEM.
Abstract
Direcionamento de células específicas na resolução ultraestrutural dentro de uma população mista de célula ou um tecido pode ser conseguida de imagem hierárquica usando uma combinação de luz e microscopia eletrônica. Amostras embutidas resina são seccionadas em matrizes consiste em fitas de centenas de seções ultra-finas e depositadas em pedaços de bolacha de silicone ou lamelas feito revestidas. Matrizes são imagens em baixa resolução usando um consumidor digital como a câmera do smartphone ou microscópio de luz (LM) para uma visão geral rápida de grande área ou um microscópio de fluorescência de campo largo (luz a microscopia de fluorescência (FLM)) após a rotulagem com fluorophores. Depois da pós-coloração com metais pesados, matrizes são fotografadas em um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Seleção de alvos é possível partir de reconstruções 3D geradas por FLM ou reconstruções 3D feitas das pilhas SEM imagem em resolução intermediária se sem marcadores fluorescentes estão disponíveis. Para análise ultraestrutural, alvos selecionados são finalmente gravou no SEM em alta resolução (pixels de imagem de alguns nanômetros). Uma ferramenta de manipulação de fita que pode ser adaptada para qualquer ultramicrotome é demonstrada. Ajuda com produção de matriz e remoção de substrato do barco faca corte. Uma plataforma de software que permite a imagem automatizada de matrizes na SEM é discutida. Em comparação com outros métodos de geração de dados de grande volume EM, tais como SEM rosto-bloco serial (SBF-SEM) ou feixe de íon focalizado SEM (FIB-SEM), essa abordagem tem duas vantagens principais: (1) a amostra de resina-incorporado é conservada, embora em uma versão cortada. Pode ser manchado de maneiras diferentes e fotografada com diferentes resoluções. (2) uma vez que as seções podem ser manchadas de pós, não é necessário usar amostras fortemente manchada de bloco com metais pesados para introduzir o contraste para a imagem latente SEM ou processar blocos o tecido condutor. Isto torna o método aplicável a uma grande variedade de questões biológicas e materiais. Materiais particularmente prefixado por exemplo, de bancos de biópsia e laboratórios de patologia, pode diretamente ser incorporado e reconstruído em 3D.
Introduction
Para grandes volumes de tecido na resolução ultraestrutural de reconstruir um número de diferentes abordagens de imagens baseado em SEM ter sido usado1: avaliações abrangentes são disponíveis por exemplo., SBF-SEM2, FIB-SEM3e matriz Tomografia computadorizada (no)4. Enquanto para o último método material de amostra é preservado como uma matriz de seriais seções sobre um substrato, SBF-SEM e FIB-SEM são métodos destrutivos, trabalhando no bloco de amostra e consumi-la durante a imagem latente. Devido a carga da resina no SEM, eles também dependem fortemente metalizado amostra blocos5.
Por outro lado, identificar certas células ou estruturas de interesse dentro de uma amostra de tecido pode lucrar particularmente correlativo luz e microscopia eletrônica de varredura (CLEM)6,7,8. Usar o FLM para direcionamento impede a aplicação de grandes quantidades de metais pesados desde que isto iria saciar a fluorescência sinal9. Para tais apenas amostras ligeiramente metalizadas, AT é o método de escolha como matrizes podem ser facilmente pós-manchadas com heavy metal depois da imagem latente de LM. Além disso, quase qualquer tipo de amostra pode ser usado para a AT, amostras de rotina nem do patologista tesouro peito10.
Outra grande vantagem da AT é o potencial para hierárquico11 ou multi resolução de imagem12: não é necessário para tudo em alta resolução de imagem, como alvos podem ser selecionados em uma modalidade diferente (por exemplo, FLM) ou em imagens de baixa resolução SEM. Somente as regiões interessantes de uma população de tecido ou célula em alta resolução de imagem economiza espaço de armazenamento de dados digitais e produz pequenos conjuntos de dados de imagem, que são mais fáceis de lidar. Aqui, o fluxo de trabalho AT é demonstrado usando uma amostra bastante fracamente metalizada: alta pressão congelado as raízes das plantas (Arabidopsis thaliana) incorporado em resina hidrofílica.
Como as matrizes são preparadas, manchadas e fotografadas em FLM e SEM, e como as pilhas de imagem são registradas são explicados. Além disso, como a reconstrução 3D do volume FLM pode ser usada para selecionar células específicas para a imagem latente no SEM em nanoescala resolução é ilustrada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Demonstrou-se um fluxo de trabalho para o direcionamento de células específicas dentro de um tecido por AT hierárquica multimodal: uma amostra de resina-incorporado é rasgada em matrizes de seriais seções, que são colocadas em um substrato condutor usando um suporte de substrato personalizados. Depois de rotulagem com um fluoróforo e imagem no FLM, o volume reconstruído é usado para selecionar as células alvo. Após coloração adicionais rodadas com metais pesados para introduzir o contraste, esses destinos são imaginados durante várias cem seções em nanoescala resolução em um SEM usar uma plataforma de software automatizado.
Para a produção de matrizes densamente com várias fitas longas, um titular de substrato semelhante à descrita aqui é necessário. Uma pessoa hábil e paciente pode ser capaz de anexar várias fitas para um substrato de silício, semi imerso no barco a faca e recuperar a matriz, reduzindo gradualmente o nível da água até as fitas estão sentados sobre o substrato. No entanto, na nossa experiência, há uma tendência para quebrar a formação quando o substrato está tocando em qualquer parte do barco faca (cf. nota no 1.3.2 no protocolo). Além disso, este procedimento é muito mais difícil com substratos revestidos ITO: (1) devido a transparência do vidro-ITO, é difícil ver a borda da água onde as extremidades das fitas tem que ser anexado; e (2) porque a superfície ITO-revestido é muito mais difícil do que a bolacha de silício altamente polido, as fitas tendem a quebrar durante o elevador e fragmentos menores, consistindo de algumas seções podem flutuar, destruindo assim a ordem das seções.
O fluxo de trabalho inteiro também é viável sem correlação com dados FLM. Neste caso, coleta de dados no SEM pode ter que ser executadas em várias sessões. Uma reconstrução 3D inicial ou pelo menos a avaliação de dados de baixa ou média resolução pode ser necessária para identificar alvos. Além disso, manchas histológicas convencionais para brightfield LM (não exigindo FLM) podem ser aplicadas. Claro que outras opções6,7,8 são anticorpos rotulagem nos arrays, como já demonstrado no livro inicial sobre a18, ou geneticamente codificado proteínas fluorescentes (XFPs) ou pré-incorporação de rotulagem com preservação da fluorescência durante a preparação da amostra.
Uma limitação geral do método discutido é o uso de seções de uma certa espessura e a amostragem discreta resultante do volume 3D: resolução em Z só pode ser tão bom quanto a espessura das seções, desde que o SEM recolhe apenas os dados da superfície de seção (d epending sobre a energia de energia primária/aterragem selecionada). Isto significa que o volume 3D resultante tem voxels anisotrópicos, por exemplo., 5 x 5 x 100 nm3 se 100 nm seções e um tamanho de pixel de imagem de 5 nm são usados. Para entidades muito pequenas em uma escala de tamanho abaixo de 1 µm, isto pode não ser suficiente para uma verdadeira descrição ultraestrutural. Uma limitação mais técnica é a precisão do palco usado no SEM para automatizada de imagem. Devido a isto, é necessário escolher um ROI maior do que as especificações de precisão do palco para garantir que a área de destino completo é fotografada.
Comparado a SBF-SEM e FIB-SEM como métodos de imagem de cara-de-bloco, o correlativo AT tem a desvantagem definitiva de voxels anisotrópicos, conforme descrito acima. Com FIB-SEM, voxels isotrópicos de 5 x 5 x 5 nm3 podem ser obtidos quando uma correção adequada deriva está no local.
Lacunas no volume reconstruído devido à perda de seções durante a preparação de matrizes podem também ser uma preocupação que não é encontrada com a SBF-SEM ou FIB-SEM. Com a estabilização de bom da fita pela colagem, geralmente é apenas um problema para a última seção de uma fita: pode ser danificado quando liberá-lo do fio do navalha, usando o cílio. No entanto, em nossa experiência, a perda de uma seção em todas as seções de 20 – 50 não influi registro de imagem.
Por outro lado, a possibilidade de pós-manchar matrizes confere bom sinal e contraste para a imagem latente SEM, mesmo em amostras fracamente metalizadas, tais como a alta pressão congelados dicas de raiz, mostradas aqui. Portanto, não é necessário comprometer óptima preservação ultraestrutural por numerosos fixação química e passos de metalização. Além disso, amostras de rotina do laboratório de patologia com graus intermédios de metalização entregam dados excelente10. Tal um realce de contraste pós-incorporação não é possível para SBF-SEM e FIB-SEM em geral. Além disso, desde que estes métodos são destrutivos, ou seja, consumindo a amostra durante a geração de imagens, hierárquica em sites e diferentes resoluções de imagem ou imagens repetidas em pontos mais tarde no tempo é impossível. Em princípio, volumes ilimitados, consistindo de grandes FOVs (por exemplo, até vários milímetros para cérebro de rato inteiro em connectomics) criado por mosaicos de costura, e um número enorme de seções pode ser adquirido por AT, enquanto na FIB-SEM, FOVs além de 100 µm x 100 µm são difíceis de alcançar com instrumentos de rotina.
Mais automação de fluxo de trabalho-AT descrito seria uma vantagem definitiva, desde que os métodos acima mencionados SBF-SEM e FIB-SEM realizar tanto de seccionamento e de imagem dentro o mesmo instrumento de forma totalmente automatizada. Existe um tipo de automação de corte: ATUMtome The12 pode gerar e coletar milhares de seções, mas o uso de fita Kapton como um substrato faz com que tais matrizes difíceis de imagem em um FLM. Sobre as lamelas ITO-revestido usadas aqui, imagem de super-resolução até deve ser possível. Um alvo mais longe, muito desejável para automação seria a gravação de pilhas de dados FLM. Por outro lado, automação pode ser cara e exceto o titular do substrato, o fluxo de trabalho aqui apresentado baseia-se (em termos de hardware) apenas na instrumentação geralmente disponível em uma rotina EM laboratório ou núcleo facilidade, tornando-o baixo nível de acesso.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão FKZ 13GW0044 do Ministério Federal alemão de educação e pesquisa, projeto MorphiQuant-3D. Agradecemos Bartels Carolin para suporte técnico.
Materials
| Instrumentation | |||
| Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
| Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
| Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
| Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
| Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
| Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
| Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
| FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sectioning | |||
| Razor blades | Plano | T585-V | |
| Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
| Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
| Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
| ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
| Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
| Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
| Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
| Diamond scriber | Plano | T5448 | |
| Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
| Brush | Selfmade | ||
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
| Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
| Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
| Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
| Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
| Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
| Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
| Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
| Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
| NaOH pellets | Merck | 106469 | |
| 1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
| Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting | |||
| Stubs | Plano | G301F | |
| Carbon pads | Plano | G3347 | |
| Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
| Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions/mixtures | |||
| Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
||
| Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
||
| Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
| Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |
References
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