تصوير هرمي متعدد الوسائط من مقاطع المسلسل للعثور على أهداف محددة الخلوية داخل كميات كبيرة
Summary
ويستهدف هذا البروتوكول خلايا معينة في الأنسجة للتصوير بدقة النانو باستخدام المسح الإلكتروني المجهري (SEM). أولاً يتم تصويرها أعدادا كبيرة من مقاطع المسلسل من المواد البيولوجية جزءا لا يتجزأ من الراتنج في مجهر خفيفة لتحديد الهدف ومن ثم بطريقة هرمية في sem.
Abstract
يمكن استهداف الخلايا المحددة في القرار ultrastructural داخل خلايا مختلطة سكان أو أنسجة بتصوير التسلسل الهرمي باستخدام مزيج من الضوء والمجهر الإلكتروني. مقطوع في صفائف تتألف من شرائط المئات من المقاطع سامسونج عينات جزءا لا يتجزأ من راتنج وأودعت في قطعة من رقاقة السيليكون أو كوفيرسليبس كوندوكتيفيلي المغلفة. صفائف يتم تصويرها بدقة منخفضة باستخدام مستهلك رقمية مثل كاميرا الهاتف الذكي أو مجهر الضوء (LM) لمحة سريعة مساحة كبيرة، أو مجهر الأسفار ميدانية واسعة (الفلورية الخفيفة الميكروسكوب (FLM)) بعد وضع العلامات مع فلوروفوريس. بعد بعد تلطيخ مع المعادن الثقيلة، صفائف يتم تصويرها في المسح الإلكتروني المجهري (SEM). من الممكن اختيار الأهداف من إعادة البناء ثلاثي الأبعاد التي تم إنشاؤها بواسطة FLM أو من إعادة البناء ثلاثي الأبعاد مصنوعة من الكدسات SEM الصورة بدقة متوسطة في حالة توفر لا علامات مضيئة. لتحليل ultrastructural، تسجل الأهداف المحددة وأخيراً في وزارة شؤون المرأة في الاستبانة (بضعة نانومتر الصورة بكسل). ويتجلى أداة التعامل مع الشريط الذي يمكن تحديثه وتعديله لأي أولتراميكروتومي. وهو يساعد مع مجموعة الإنتاج وإزالة الركيزة من القارب سكين تقطيع. وتناقش منصة برمجيات يتيح التصوير الآلي للمصفوفات في وزارة شؤون المرأة. مقارنة بالأساليب الأخرى توليد البيانات كبيرة الحجم م، مثل الوجه كتلة المسلسل SEM (SBF-وزارة شؤون المرأة) أو تركيز أيون شعاع (التعزيز-وزارة شؤون المرأة)، ووزارة شؤون المرأة وهذا النهج قد اثنين من المزايا الرئيسية: (1) المحافظة عليها العينة جزءا لا يتجزأ من الراتنج، لو في إصدار شرائح إلى أعلى. يمكن أن تكون ملطخة بطرق مختلفة وتصويرها مع قرارات مختلفة. (2) كما يمكن أن تكون المقاطع الملون بعد، فإنه ليس من الضروري استخدام عينات الملطخة بشدة من كتلة مع المعادن الثقيلة ليعرض على النقيض لتصوير SEM أو تقديم كتل الأنسجة الموصلة. وهذا يجعل الطريقة التي تنطبق على مجموعة واسعة من المواد والمسائل البيولوجية. مسبوقة وبخاصة المواد مثلاً، من المصارف خزعة ومختبرات علم الأمراض، يمكن مباشرة المضمنة وإعادة بنائها في 3D.
Introduction
لإعادة بناء كميات كبيرة من الأنسجة بدقة ultrastructural عدد من النهج التصوير مختلفة استناداً إلى وزارة شؤون المرأة قد تم المستخدمة1: استعراضات شاملة متوفرة على سبيل المثال., SBF-وزارة شؤون المرأة2والتعزيز-وزارة شؤون المرأة3الصفيف التصوير المقطعي (في)4. بينما للأسلوب الأخير هو الحفاظ على المواد عينة كمجموعة مقاطع المسلسل على الركازة، SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز هي الأساليب المدمرة، تعمل على كتلة العينة واستهلاكها أثناء التصوير. بسبب فرض الراتنج في وزارة شؤون المرأة، أنها تعتمد أيضا على كتل عينة ميتاليزيد بقوة5.
من ناحية أخرى، تحديد بعض الخلايا أو الهياكل ذات الاهتمام داخل عينة أنسجة يمكن أن تستفيد خصوصا من الضوء الارتباطية والمجهر الإلكتروني (كليم)6،،من78. استخدام FLM لاستهداف يحول دون تطبيق كميات كبيرة من المعادن الثقيلة منذ هذا شأنه إخماد إشارة fluorescence9. لهذه العينات metalized قليلاً فقط، هو في طريقة الاختيار منذ صفائف يمكن بسهولة بعد الملون مع المعادن الثقيلة بعد تصوير LM. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام تقريبا أي نوع من أنواع العينة لفي, عينات روتينية حتى من الطبيب كنز الصدر10.
هي ميزة كبيرة أخرى في إمكانية هرمية11 أو التصوير المتعدد القرار12: ليس من الضروري صورة كل شيء في الاستبانة، كما يمكن تحديد الأهداف بطريقة مختلفة (مثلاً، FLM) أو في الصور المنخفضة الوضوح ووزارة شؤون المرأة. تصوير المناطق المثيرة للاهتمام فقط من السكان الأنسجة أو الخلايا في الاستبانة يوفر مساحة تخزين البيانات الرقمية وتنتج مجموعات بيانات الصورة أصغر، وأسهل للتعامل. هنا، هو أثبت سير العمل في استخدام عينة بل metalized ضعيفة: الضغط العالي تجميد جذور النبات (نبات التمويل) جزءا لا يتجزأ من الراتنج ماء.
يتم شرح كيف أعد لمصفوفات والملون وتصويرها في FLM ووزارة شؤون المرأة، وكيف تسجل رصات الصور. أيضا، يتضح كيف يمكن استخدام إعادة حجم FLM 3D لتحديد خلايا معينة للتصوير في وزارة شؤون المرأة بدقة النانو.
Protocol
Representative Results
Discussion
سير عمل لاستهداف خلايا معينة داخل أنسجة بالنقل المتعدد الوسائط في هرمية تجلى: عينة جزءا لا يتجزأ من الراتنج هو شرائح إلى صفائف مقاطع المسلسل، التي يتم وضعها على الركازة موصلة باستخدام حامل الركيزة خصيصا. بعد وضع العلامات مع فلوروفوري والتصوير في FLM، يتم استخدام حجم أعيد بناؤها لتحديد الخلايا المستهدفة. بعد جولات تلطيخ إضافية مع المعادن الثقيلة ليعرض على النقيض، يتم تصويرها هذه الأهداف على عدة أقسام مئات دقة النانو في SEM استخدام منصة برمجيات الآلي.
لإنتاج صفائف كثافة مع عدة شرائط طويلة، حامل الركيزة مشابهة لتلك الموضحة هنا ضروري. قد يكون شخص المريض وغير المهرة قادرة على إرفاق عدة شرائط الركازة سليكون، شبه مغمورة في زورق سكين, واسترداد الصفيف بخفض منسوب المياه تدريجيا حتى يجلسون الشرائط على الركازة. ومع ذلك، في تجربتنا، هناك ميل تحطيم تشكيل عند الركيزة لمس أي جزء من القارب سكين (انظر الملاحظة في 1.3.2 في البروتوكول). وبالإضافة إلى ذلك، هذا الإجراء أكثر صعوبة مع ركائز المغلفة إيتو: (1) نظراً لشفافية إيتو-الزجاج، من الصعب رؤية حافة الماء حيث قد ينتهي الأشرطة ترفق؛ و (2) لأن السطح المغلفة إيتو أخشن كثيرا من رقاقة السيليكون مصقول للغاية، الشرائط تميل إلى كسر أثناء الرفع وقد تعدت شظايا صغيرة تتألف من بعض الأقسام، وبالتالي تدمير ترتيب المقاطع.
من الممكن أيضا سير العمل كله دون الارتباط ببيانات FLM. وفي هذه الحالة، قد يكون جمع البيانات في وزارة شؤون المرأة القيام بها في عدة دورات. إعادة بناء ثلاثي الأبعاد أولية أو على الأقل قد يكون من الضروري لتحديد أهداف التقييم البيانات دقة منخفضة أو متوسطة. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتم تطبيق البقع النسيجي التقليدية برايتفيلد LM (التي لا تتطلب FLM). وبطبيعة الحال، هي الأخرى خيارات6،7،8 جسم وضع العلامات على الصفائف، كما تبين فعلا في الورقة الأولى في الساعة18، أو وراثيا ترميز البروتينات الفلورية (إكسفبس) أو قبل تضمين العلامات مع المحافظة على الأسفار أثناء إعداد عينة.
حد عامة لمناقشة الأسلوب هو استخدام المقاطع لسماكة معينة وعينات منفصلة الناتجة من الحجم الثلاثي الأبعاد: القرار في Z يمكن فقط جيدة مثل سمك الفروع منذ SEM بجمع البيانات فقط من سطح القسم (د ابيندينج على الطاقة الأولية الطاقة/الهبوط المحدد). وهذا يعني أن حجم ثلاثي الأبعاد الناتجة متباين فوكسيلس، على سبيل المثال.، 5 × 5 × 100 nm3 إذا 100 أقسام نانومتر وحجم بكسل صورة 5 نانومتر المستخدمة. لكيانات صغيرة جداً في نطاق حجم أدناه 1 ميكرومتر، وهذا قد لا تكون كافية لوصف ultrastructural حقيقية. هو القيد تقنية أكثر دقة المرحلة التي تستخدم في وزارة شؤون المرأة للتصوير الآلي. ونتيجة لهذا، من الضروري اختيار دوروا أكبر من مواصفات دقة المرحلة لضمان أن يتم تصويرها منطقة الهدف الكامل.
مقارنة SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز ككتلة-الوجه من أساليب التصوير، قد ستتحقق في نهائي ومن سيئات فوكسيلس متباين، كما هو موضح أعلاه. مع التعزيز-وزارة شؤون المرأة، يمكن الحصول على الخواص فوكسيلس 5 × 5 × 5 نانومتر3 عند تصحيح الانحراف سليم في المكان.
الثغرات في حجم أعيد بناؤها بسبب فقدان المقاطع أثناء إعداد مصفوفات يمكن أيضا قلق من أن عدم مصادفة مع SBF-وزارة شؤون المرأة أو التعزيز-وزارة شؤون المرأة. مع تثبيت الشريط جيدا بالغراء، وهذا عادة فقط مسألة للجزء الأخير من الشريط: قد يكون معطوباً عند إطلاقه من حد السكين تستخدم في جفن. ومع ذلك، في تجربتنا، الخسارة في قسم واحد في كل الأقسام 20 – 50 لا تؤثر تسجيل الصورة.
من ناحية أخرى، يمنح إمكانية مرحلة ما بعد وصمة عار صفائف إشارة جيدة والتباين للتصوير ووزارة شؤون المرأة، وحتى على عينات ميتاليزيد ضعيفة مثل ارتفاع الضغط المجمدة تلميحات الجذر هو موضح هنا. ولذلك، فإنه ليس من الضروري التوصل إلى حل وسط المحافظة ultrastructural الأمثل بالعديد من التثبيت الكيميائي وخطوات التلميع. أيضا، تقديم عينات روتينية من مختبر علم الأمراض بدرجات متوسطة من المعدنة بيانات ممتازة10. تعزيز النقيض بعد تضمين مثل هذه لا يمكن SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز بصورة عامة. وعلاوة على ذلك، وبهذه الطرق المدمرة، أيتستهلك العينة أثناء التصوير، هرمية التصوير في قرارات مختلفة ومواقع أو التصوير المتكرر في نقطة لاحقة في وقت مستحيل. من حيث المبدأ، إنشاء وحدات التخزين غير محدودة، تتألف من FOVs كبيرة (مثلاً، تصل إلى عدة ملليمترات للعقول الماوس كله في كونيكتوميكس) بخياطة الفسيفساء، وإعدادا هائلة من المقاطع يمكن اكتسابها من خلال تي، بينما في التعزيز-وزارة شؤون المرأة، FOVs تتجاوز 100 ميكرومتر µm x 100 ويصعب تحقيق مع الصكوك الروتينية.
زيادة التشغيل الآلي في وصف-سير العمل سيكون ميزة أكيدة، منذ تنفيذ الأساليب المذكورة أعلاه SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز تمزيقها والتصوير داخل نفس الصك بطريقة مؤتمتة بالكامل على حد سواء. يوجد نوع واحد من التشغيل الآلي لتقطيع: “أتومتومي”12 ويمكن توليد وجمع آلاف مقاطع، ولكن استخدام Kapton الشريط الركازة يجعل مثل صفائف صعبة للصورة في FLM. على كوفيرسليبس إيتو المغلفة المستخدمة هنا، ينبغي أن يكون تصوير القرار فائقة حتى ممكن. وسيكون هدف مرغوب فيه جداً، وكذلك لأتمتة تسجيل رزمة البيانات FLM. من ناحية أخرى، التشغيل الآلي يمكن أن تكون مكلفة وفيما عدا صاحب الركازة، يعتمد سير العمل المقدمة هنا (من حيث الأجهزة) فقط على الأجهزة التي تتوفر عادة في م روتينية مرفق المختبر أو الأساسية، مما يجعل من انخفاض مستوى الوصول.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل 13GW0044 فكز منحة من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث، ومشروع مورفيكوانت-3D. ونحن نشكر “بارتلز كارولين” للدعم التقني.
Materials
| Instrumentation | |||
| Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
| Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
| Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
| Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
| Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
| Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
| Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
| FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sectioning | |||
| Razor blades | Plano | T585-V | |
| Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
| Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
| Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
| ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
| Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
| Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
| Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
| Diamond scriber | Plano | T5448 | |
| Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
| Brush | Selfmade | ||
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
| Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
| Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
| Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
| Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
| Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
| Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
| Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
| Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
| NaOH pellets | Merck | 106469 | |
| 1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
| Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting | |||
| Stubs | Plano | G301F | |
| Carbon pads | Plano | G3347 | |
| Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
| Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions/mixtures | |||
| Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
||
| Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
||
| Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
| Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |
References
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience. J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
- Wacker, I., Schröder, R. R. Array tomography. J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).
- Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).
- Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures. Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Verkade, P., Müller-Reichert, T. . Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1-352 (2017).
- Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -. M. Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design. Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).
- Wacker, I., Schröder, R. R., Schroeder, J. A. Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample. Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).
- Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schröder, R. R. Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biol. 17 (1), 38 (2016).
- Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, (2014).
- Micheva, K. D., O’Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. Array Tomography: Production of Arrays. Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).
- Fahrenbach, W. H. Continuous serial thin sectioning for electron microscopy. J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).
- Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
