Multimodale hiërarchische beeldvorming van seriële secties voor het vinden van specifieke cellulaire doelen binnen grote Volumes

Opmerking: Monster blokken moeten worden polymeervorm en sommige zware metalen bevatten. Fixatie en insluiten van protocollen voor de twee monsters weergegeven in figuur 1A-B zijn beschreven elders11. Kortom, is afgebeeld in figuur 1A chemisch vastgesteld, gekleurd en bloc eerste met 1% OsO4, vervolgens met 1% uranyl acetaat, en ingesloten in Spurr de hars. Afgebeeld in figuur 1B was hogedruk bevroren, bevriezen gesubstitueerd met 0,4% uranyl acetaat in aceton, en ingesloten in Lowicryl HM20 hars. Gebruik poeder gratis handschoenen voor de volgende stappen voor de voorbereiding. 1. het creëren van Arrays Trimmen van het monster blokOpmerking: Draai altijd schroeven goed bij het invoegen van onderdelen. Het monster blok invoegen de monsterhouder van de ultramicrotome, plaats de houder in het blok trimmen en schuif het in de lagere fase van de ultramicrotome. Trim weg hars rond het ingesloten weefsel met een scheermesje verlaten van slechts een kleine rand van hars rond het monster. Bijsnijden vanaf de bovenkant totdat het doel is bereikt.Opmerking: De vorm van de blok-gezicht wellicht trapezium of rechthoekig (we hebben met succes gebruikt beide shapes). Het is belangrijk om het gebruik van de lange zijden van de rechthoek als de toonaangevende en achterrand om ervoor te zorgen dat een groot gebied wordt bestreken door het mengsel van de lijm de linten te stabiliseren. Invoegen van de monsterhouder in de tak van de ultramicrotome en vervang het blok trimmen in de lagere fase door de meshouder. Een diamant trim mes (normaal gesproken 45°), in de meshouder invoegen. Hiermee lijnt u de blok-face precies parallel aan de rand van de trim mes.Opmerking: Om te produceren precies parallel leiden (onderkant) en achterstand (bovenrand), draai of Verplaats alleen het mes om trim tegenover elkaar gelegen zijden. Voor grote volumes (meer dan enkele honderden secties) is een 90° trim mes voordelig. Alle vier de zijden glad, en draai daarna aan de monsterhouder zodat de toonaangevende en achterrand nu in de horizontale positie zijn. Zorgvuldig jas de voorloop- en volgspaties zijkanten van het blok met zelfklevende mengsel. Gebruik een kleine borstel gevormd uit een paar haren vast aan een tandenstoker13. Voer deze stap snel omdat het oplosmiddel van dit mengsel binnen seconden verdampt. Het blok-gezicht met dit mengsel niet vervuilen. Laat het blok van de gecoate monster gedurende 5-10 min. drogen.Opmerking: voor grotere aantallen secties (> 200), het kan beter zijn om de voorrand alleen, jas, omdat met de tijd een verdikking van de lijm kan op de achterrand opbouwen, en potentieel secties over het scherp van de snede terugtrekken. Bereiding van het substraat Gesneden stukjes van silicium wafers tot een formaat dat in de mes-boot (ongeveer 2 x 2.5 cm2 voor de Jumbo-mes past). Indien nodig, de wafer stukken (cijfers of letters) met een diamant scriber voordat u gaat schoonmaken of markeren met permanente marker na reiniging. Reinig de silicium wafer handmatig met isopropanol en pluisvrije weefsel.Opmerking: Gebruik voor oereenstemming imaging indium-tin-oxide (ITO)-gecoat glas coverslips. Ze moeten zeer voorzichtig worden omgegaan, en extra schoonmaak is niet nodig. Het substraat op één uiteinde van de draagplaat geleverd met een verwijderbare lijm vast te stellen.Opmerking: Als alternatief, de randen van het substraat kunnen worden gespeld neer parallel aan het scherp van de snede met behulp van twee strepen van plakband. Plasma activeren (gloed kwijting) het substraat met lucht te verkrijgen van een hydrofiele oppervlak. Dit moet gebeuren op een zodanige wijze dat een druppel water op het substraat uitspreidt aan een zeer dunne film (lage contacthoek, figuur 2C, D) geplaatst. Hydrophilization parameters is afhankelijk van het apparaat van de plasma gebruikt; Zie Tabel van materialenvoor de hier gebruikte parameters.Opmerking: Plasma activering is zeer volatiel, dus dit uit te voeren vóór het gebruik van substraat. Plaats de vervoerder in de klem van een substraat houder, met een gemonteerde substraat dichter op het scherp van de snede te bereiken optimale bevochtiging van de coating in de mes-boot.Opmerking: Een gedetailleerde beschrijving van de houder van de ondergrond, met inbegrip van de computer-aided design (CAD) tekeningen, wordt gegeven in Wacker et al. 11 Afdelen voorbereiding Invoegen van een Jumbo diamant mes in de meshouder, instellen van de hoek van de klaring (0° voor Jumbo mes), en vul de mes-boot met gedestilleerd water. Aanpak het mes tot een afstand van 1 – 2 mm aan het monster. Lager het substraat in het water met behulp van schroeven 1 – 3 (figuur 2A) van de houder van het substraat. Controleer dat de waterlijn zich in het bovenste derde van het substraat bevindt.Opmerking: Controleer dat de lijm tussen de ondergrond en vervoerder plaat goed genezen is door het verschuiven van het substraat met schone pincet. Het moet niet verplaatsen. Want het is moeilijk om te zien de bodemvrijheid bij het gebruik van een silicium wafer, lager het substraat totdat je voelt dat het raken de vloer. Nu verhogen het substraat een klein bedrag. Zorg ervoor dat het substraat noch de vervoerder de mes-boot terwijl snijden raakt. Gebruik een spuit of pipet om het waterniveau in de boot. Terwijl u door de verrekijker kijkt, toevoegen of verwijderen van water totdat het volledige gebied van het wateroppervlak een homogene weerspiegeling van de bovenste lichte verlichting van de ultramicrotome toont. Schakel in het licht van de onderkant van de ultramicrotome. Zorg ervoor dat de arm in de middelste positie en niet in retractie met behulp van het handwiel van de ultramicrotome. Aanpak het mes van het monster tot de reflectie van het scherp van de snede is zichtbaar op het gezicht van het blok. Gebruik de opties voor aanpassing van de ultramicrotome voor het uitlijnen van het monster, tot het mes. Ten eerste draaien van het mes, dan draaien en kantelen van het monster.Opmerking: Het is de juiste manier uitgelijnd als de lichte streep, die kan worden gezien in de kloof tussen het monster en het mes, parallelle randen (rechte parallelle lijnen en niet wig toont-vormige). Controleer de helling van het monster: ervoor te zorgen dat de lichte streep niet dikker worden of dunner terwijl het bewegen van het monster op en neer. Indien nodig, gebruik de stelschroeven boog om dit te corrigeren. Verplaats het mes dichter naar het monster totdat het is net boven de blok-face (maar niet voldoet). Sectie dikte (feed), snijden van snelheid en snijden venster bij de controle-eenheid instellen. Afdelen starten Indien nodig, wachten tot de eerste volledige sectie is ingekrompen. Sommige secties gesneden om er zeker van te zijn dat ze elkaar aan formulier linten vasthouden (anders de lijm moet opnieuw worden toegepast). Beginnen met een hoogwaardige diervoeders (maximaal 200 nm voor de Ultra mes) totdat het eerste volledige sectie is ingekrompen. Vervolgens stelt u de gewenste feed waarde. Voor voldoende lint stabiliteit, een sectie dikte van 100 nm en een snijsnelheid van 1 mm/s is een goed uitgangspunt. De laagste haalbare sectie dikte is ongeveer 60 nm, afhankelijk van de kwaliteit van de steekproef. Stop segmenteren. Verwijder alle overbodige (gedeeltelijk geslepen) secties uit het scherp van de snede en boot met behulp van een wimper/kat van haar. Als er een heleboel kleine puin rondzweven, verwijder het water compleet met een pipet en de boot vullen met vers water. Het proces is nu klaar voor het eerste productieve lint. Afdelen Afdelen starten Zodra een aantal secties (het werkelijke aantal is afhankelijk van de grootte van de secties en substraat) heeft verlaagd, stoppen met het vectorafbeeldingsbestanden proces en het lint van het scherp van de snede vrij door zachtjes strelen over het scherp van de snede met een wimper14 of beter nog, met een zeer zachte haren van de vacht van een kat. Manipuleren (push-/ pull) het lint met de wimper richting het substraat en het eerste gedeelte hechten op de ondergrond.Opmerking: Het is nodig om het lint zachtjes duwen totdat het houdt zich aan het droge deel van het substraat. Blijven afdelen en de linten te koppelen aan de ondergrond. Beginnen aan de ene kant en geleidelijk over naar de andere met elke nieuwe lint.Opmerking: Vermijd massale water bewegingen om te voorkomen dat het losdraaien van de al toegevoegde linten. Hetzelfde geldt voor luchtstromen. Het adem-shield geleverd met de ultramicrotome gebruiken. In ongunstige omgevingsfactoren verdient een behuizing voor de ultramicrotome15. Wanneer het substraat is volledig bedekt met linten (meestal 4 – 5 linten zijn haalbaar), zachtjes lift-out het substraat vanaf de boot van de mes met behulp van de schroeven van de micromanipulator van de houder van het substraat.Opmerking: Geschikt bewegingen zijn: verticaal verheffen (1 schroef) en draaien/kantelen uit (schroef 3), of een combinatie van beide. Laat de lint-matrix drogen alvorens het op te slaan in een stofvrije omgeving. Na het drogen, verwijderen de zelfklevende gemonteerde substraat zo spoedig mogelijk van de vervoerder (op dezelfde dag, anders het substraat kan ook moeilijk te verwijderen of zelfs kan breken tijdens de demontage). 2. kleuring voor de beeldvorming LM Opmerking: Verschillende kleuring/labeling methoden zijn mogelijk, met inbegrip van immunofluorescentie protocollen. Hier is een directe, tamelijk aspecifieke vlek gekozen te schetsen van de celwanden. Propidium jodide kleuring Bedek de bodem van een groot glas petrischaal (diameter 30 cm) met parafilm en lijn van de rand van de schotel met vochtige tissues om te bouwen van een vochtige kamer. Gebruik ongeveer 300-500 µL van oplossing per dekglaasje aan. Plaats één druppel voor elke dekglaasje aan op de parafilm en zet het glas ondersteboven op de daling, zodat de secties in contact met de kleuring vloeistof zijn. Dekking van de schotel en wikkel het met aluminiumfolie om de monsters te beschermen tegen licht. Incubeer de monsters gedurende 16 uur bij 4 ° C. Verwijder het dekglaasje aan met een tang en wassen door het omhoog en omlaag te verplaatsen in een bekerglas van 100 mL gevuld met 80 mL gedestilleerd water. Herhaal deze stap in een andere bekerglas met vers water. Droog het dekglaasje aan zorgvuldig met perslucht. 3. het vastleggen van de afbeeldingsstapel in de DLM Plaats het dekglaasje aan op het podium van een gemeenschappelijk breed-gebied FLM. Kies de gewenste filter set (Tabel of Materials) voor de fluorescentie in acht moeten worden genomen. Met een geschikte objectief, nemen een afbeelding van het object in elke sectie: probeer te vullen van het gezichtsveld en de afdrukstand constant te houden. Voor de root-tip, werd een 40 X lucht doelstelling gebruikt.Opmerking: Als de linten niet perfect recht zijn, een roterende fase kan helpen om dit te heroriënteren in de secties terwijl het nemen van beelden. Indien mogelijk, centreren in het beeld op een specifieke functie of een functie zoals de bovenrand van de sectie op een gelijke afstand te houden tot aan de rand van het opgenomen beeld. Gebruik, indien mogelijk, 16 bit te beperken van verzadigde pixels en de blootstellingstijd constant te houden. 4. registratie van de DLM afbeeldingsstapel Importeer de afbeelding serie in Fiji16 als een virtuele stapel. Open een nieuwe TrakEM17 (lege) in het bestandsmenu. Klik met de rechtermuisknop in het afbeeldingsveld, en importeer de stack in TrakEM als “Één segment per laag”. Uitlijnen van lagen (rechts klikken in de afbeeldingsveld), de reeks (eerste beeld naar de laatste), en kies ‘ geen ‘ als referentie. Gebruik de standaardwaarden voor alle instellingen, en kies stijf als de gewenste transformatie. Wanneer de registratie voltooid en bevredigend is, sla de uitgelijnde dataset door Klik met de rechtermuisknop en kies exporteren. Maken van installatiekopieën, de reeks van de eerste tot de laatste afbeelding, en laat de software weergeven van de resulterende stack. De stack in tif-indeling opslaan. 5. kleuring en montage voor de beeldvorming van SEM Opmerking: Zie Tabel van materialenvoor voorbereiding van kleuring oplossingen. Oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal 12 maanden, beschermd tegen licht en lucht. Let op: Loodacetaat citraat en uranyl bevatten zware metalen die giftig zijn. Draag handschoenen en gooi het afval volgens de instructies van de lokale autoriteiten. Bedek de bodem van een groot glas petrischaal (diameter 30 cm) met parafilm en lijn van de rand van de schotel met vochtige tissues om te bouwen van een vochtige kamer.Opmerking: Het is belangrijk dat verschillende pellets van NaOH zijn gepositioneerd binnen de petrischaal in de buurt van de kleuring druppels om te voorkomen dat buitensporige neerslag van lood citraat. Uranyl acetaat kleuring Centrifugeer de uranyl acetaat oplossing bij 2680 x g voor een paar seconden aan sediment kleine deeltjes. Gebruik ongeveer 300-500 µL van oplossing per dekglaasje aan. Plaats één druppel voor elke dekglaasje aan op de parafilm en zet het glas ondersteboven op de daling, zodat de secties in contact met de kleuring vloeistof zijn. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, en betrekking hebben op de schotel tijdens kleuring. Verwijder het dekglaasje aan met pincet en wassen door omhoog en omlaag verplaatsen in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water (zie stap 2.1.3). Leiden citraat kleuring Tijdens de uranyl acetaat incubatie, bereiden de citraatoplossing lood.Opmerking: Lood citraat moet altijd onmiddellijk vóór gebruik om eventuele precipitaten worden gefilterd. Ook de lood citraatoplossing 2680 x g centrifugeren voor een paar seconden als in stap 5.2.1. Gebruik ongeveer 300-500 µL van oplossing per dekglaasje aan. Plaats één druppel voor elke dekglaasje aan op de parafilm onmiddellijk vóór het wassen van de coverslips na de uranyl acetaat kleuring, en zet het glas ondersteboven op de daling, zodat de secties in contact met de kleuring vloeistof zijn. Plaats de druppels (300 – 500 µL) op de parafilm onmiddellijk vóór het wassen van de coverslips na de uranyl acetaat kleuring.Opmerking: Om te voorkomen dat de vorming van precipitaten, niet inademen op de voorsprong citraat druppels. Plaats de gewassen dekglaasje aan ondersteboven op de daling (er is geen behoefte om te drogen). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en betrekking hebben op de schotel tijdens de kleuring. Verwijder het dekglaasje aan met een tang en wassen zoals hierboven beschreven in een bekerglas met zoet water (stap 5.2.4). Droog het dekglaasje aan zorgvuldig met perslucht. Montage van de monsters voor de beeldvorming van SEM Monteer de silicium-wafels op aluminium categorie: met een kleverige koolstof-zeem.Opmerking: Coverslips ITO beklede kan ofwel worden gemonteerd met behulp van zilver verf en Cu-tape — Controleer of het geleidende oppervlak is aangesloten op de stub — of met koolstof pads als hierboven. In dat geval kan een geleidende verbinding van het ITO-oppervlak naar de stub gemaakt worden met een daling van zilver verf. 6. hiërarchische beeldvorming in de SEM Opmerking: Kies In een veld emissie SEM, een lage primaire energie (3 kV of lager), een stroom in een bereik van 50 tot 800 pA te vermijden opladen, en een redelijke afstand van de werken voor het efficiënt verzamelen van secundaire en/of voor de back-verstrooid elektronen lichtbundel. Selectie van de bundelstroom hangt af van de eigenschappen van het monster (bv., hars inbedding); de elektron dosis zullen ook een compromis tussen een kleine stroom (minder schadelijk voor het monster) en een hoge stroom, die gunstig is voor imaging-snelheid en daarom verlaagt de totale beeld Acquisitietijd. Speciale detectoren voor achterwaarts-verstrooid elektronen goed contrast bieden, zijn minder gevoelig voor het opladen van het monster en Toon minder van het monster de oppervlakte artefacten (plooien, mes merken). Contrast en helderheid moeten worden aangepast, zodanig dat het histogram wordt gecentreerd. SEM imaging Eerst de vier hoeken van de matrix te definiëren door een afbeelding van elke hoek op lage vergroting, over 100 x grijpen. Een gebied van belang (ROI) bijvoeging van de hele array maken. Toewijzen van een imaging protocol met de volgende parameters: een secundaire elektron (SE)-detector, waarmee een hoge snelheid beeldvorming op een grote afbeelding pixelgrootte (voor voorbeeld 1.000 nm) en een korte Nadruktijd (bijvoorbeeld 0.2 µs) gebruiken.Opmerking: Om de optische beperkingen van de elektron op een grote scannen gezichtsveld (FOV), die kan leiden tot verstoringen in de periferie van de beelden, gebruik speciale lage vergroting modi (verstrekt door de meeste fabrikanten van SEM) of medium, 1 tot 2 k scan velden voor gebruiken enkele beelden. Een sectie instellen door het creëren van een overzicht alleen het weefsel in de eerste sectie ROI te genereren. Kloon voor alle volgende secties met behulp van het gereedschap stempel. De ROIs wanneer nodig voor gebogen linten roteren. Opnemen van de reeks van de afbeelding met behulp van een tussenliggende pixelgrootte (ongeveer 50 nm) en een tijd lang genoeg om te identificeren en te herkennen van de structuur van de target wonen. Gebruik een FOV voor afzonderlijke afbeeldingen in een bereik van 6-10 k pixels.Opmerking: De Atlas 5 software kan automatisch verzamelen mozaïeken samengesteld uit aangrenzende beelden ter dekking van grote gebieden van de ROI/sectie over de seriële secties. Maak een site instellen binnen deze sectie set, met het doel structuur voor hogere resolutie SEM beeldvorming. De ROI groot genoeg maken account voor fase precisie. Controleren en aanpassen van de standpunten van de sites.Opmerking: Het is belangrijk om de ROI op zodanige wijze dat het centrum, waar de autofocus en de autostigmation zal worden uitgevoerd, niet op “leeg” materiaal met geen structurele detail, bijv zit., vacuolen. Instellingen voor de autofocus en de prestaties ten minste de controle over de lengte van een lint (dat wil zeggen, de langste afstand die het werkgebied moet reizen) op een kleine ROI dicht bij de site die zal worden beeld. Definieer een imaging protocol voor de verwerving SEM met een hoge resolutie. Om te zien membraan compartimenten, kiest u de grootte van de pixel van de afbeelding van 3 – 5 nm. Selecteer een Nadruktijd afhankelijk van de detector, zodat het beeld niet te lawaaierig is. Voordat u begint de verwerving, definieert u de waarden van de focus op ten minste het eerste gedeelte van elk lint met behulp van het selectievakje protocoloptie. Start de geautomatiseerde SEM beeldvorming over de hele reeks van target ROIs. De verworven gegevens exporteren als afbeelding serie, bij voorkeur in de tif-formaat. 7. registratie van het SEM-beeld-Stack Importeer foto serie in Fiji als een virtuele stapel.Opmerking: Deze zullen grote gegevensbestanden in het bereik van een paar GB afhankelijk van het aantal secties en de grootte van de ROI. Gewas het SEM-beeld stapelen voor verdere verwerking naar een gebied zo dicht mogelijk bij de structuur van belang mogelijk en de helderheid en het contrast aanpassen. Open een nieuwe TrakEM17 (lege) in het bestandsmenu. Klik met de rechtermuisknop in het afbeeldingsveld, en importeer de stack in TrakEM als “Één segment per laag”. Lijn de lagen (Klik met de rechtermuisknop in het afbeeldingsveld), kleinste kwadraten Kies als mode, de reeks (eerste beeld naar de laatste), en kies ‘ geen ‘ als referentie. Voor de instellingen, de standaardwaarden gebruiken en kies stijf als de gewenste transformatie. Wanneer de registratie voltooid en bevredigend is, sla de uitgelijnde dataset door Klik met de rechtermuisknop en kies exporteren. Maken van een installatiekopie zonder submappen, de reeks van de eerste tot de laatste afbeelding, en laat de software weergeven van de resulterende stack. De stack in tif-indeling opslaan.