Hoge resolutie 3D beeldvorming van het Neuro-insulaire netwerk van menselijke alvleesklier

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de Universiteit van Florida institutionele Review Board en federale richtlijnen. Let op: Paraformaldehyde en acrylamide zijn giftig irriterende stoffen. Omgaan met reagentia in een zuurkast met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen, oogbescherming). 1. deparaffinization van Formaldehyde-vaste weefsels (als met verse weefsels werkt, gaat u verder met stap 2) Gebruik een nieuwe scheermesje of scalpel te snijden door de paraffine loodrecht op het oppervlak van het weefsel. Snijd de paraffine aan de rand van het weefsel tot finish het losraken. Gebruik pincet of een spatel voorzichtig los en verwijderen het weefsel optisch worden vrijgemaakt. Voorzichtig schrapen overtollige paraffine van het weefsel met behulp van een spatel (figuur 1A). Vul een glazen container met xyleen (ongeveer 30 mL voor een 3 x 3 x 3 mm sectie van weefsel) en Incubeer het weefsel in deze oplossing gedurende 24 uur bij kamertemperatuur (RT). Vul een andere glazen container met verse xyleen met hetzelfde volume als 1.2.1. Overdracht en Incubeer het weefsel in deze oplossing gedurende 24 uur op RT. 100% ethanol in een conische buis met hetzelfde volume als 1.2.1 plaatsen. Overdracht en Incubeer het weefsel in deze oplossing gedurende 24 uur op RT. 95% ethanol in een conische buis met hetzelfde volume als 1.2.1 plaatsen. Overdracht en Incubeer het weefsel in deze oplossing gedurende 24 uur op RT. 70% ethanol in een conische buis met hetzelfde volume als 1.2.1 plaatsen. Overdracht en Incubeer het weefsel in deze oplossing gedurende 24 uur op RT. Spoelen het weefsel in 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en plaats in 0,01 M PBS in een conische buis aan equilibreer gedurende 24u op RT. Zorg ervoor dat het weefsel vrij is van paraffine (figuur 1B, rechter paneel). 2. voorbereiding van de 4% Paraformaldehyde (PFA) fixatief Pipetteer 10 mL 16% PFA in een conische buis van 50 mL, Voeg 4 mL 0,1 M PBS en voeg 26 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water (ddH2van O). Sluit het GLB en mix kort. Grotere volumes van 4% PFA vooruit en bevroren in aliquots gemaakt kan worden. Aliquots zijn goed voor 1 dag bij kamertemperatuur (RT), één week bij 4 ° C en 1 maand bij-20 ° C. 3. de alvleesklier fixatie Repareren van het monster van de alvleesklier (≤ 1 x 1 x 2 cm) in vers bereide 4% PFA bij 4 ° C gedurende 48 uur. Als het monster groter is dan 1 x 1 x 2 cm, een scalpel of scheermesje gebruiken om te ontleden in kleinere stukken niet meer dan 1 cm dik. Wassen weefsel monster in drie wijzigingen van 0,01 M PBS gedurende ten minste 15 minuten elk wassen en bewaren in de centrifugebuis 15 mL in 0.01% PFA/0,01 M PBS of 0,5% natrium azide/0,01 M PBS tot gebruik. Afdeling na fixatie, het weefsel in 1-2 mm dik secties voor verdere verwerking. Gebruik een vibratome om te helpen in zelfs segmenteren.Opmerking: Het definitieve aantal secties zal afhangen van de grootte van het eerste monster. 4. het insluiten van weefsel in Hydrogel 200 mL van de 4% acrylamide/1% paraformaldehyde (A4P1) hydrogel monomeer oplossing als volgt voorbereiden: Plaats een kolf op het ijs in een emmer op de bovenkant van een magnetische roer plaat. Zorg ervoor dat de kolf is plat zit en voeg een magnetische roer bar. Voeg de volgende in volgorde: 147.8 mL koud (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0,1 M PBS, 20 mL koud (4-8 ° C) 40% acrylamide oplossing, 12.2 mL 16% PFA oplossing en 250 mg VA-044 initiatiefnemer. Meng de hele hydrogel-oplossing met een magnetische roer bar gedurende ten minste 10 minuten en laat de oplossing op het ijs voor de volgende stap. Plaats een conische buis 15 mL in het ijs naast de kolf met de hydrogel-oplossing. Pipetteer 14 mL monomeer-oplossing in de buis en een stuk van het 1-2 mm dikke vaste weefsel monster toe te voegen. Vervolgens de buis van het GLB. Incubeer het monster in oplossing van het monomeer gedurende 3 dagen bij 4 ° C en beschermen tegen licht. Aliquot eventuele resterende monomeer oplossing en opslag bij-20 ° C voor toekomstig gebruik. 5. ontgas de oplossing van het monomeer en polymeriseren de Hydrogel Verwijderen zuurstof uit de hydrogel monomeer oplossing met behulp van gasvormige N28. Een emmer ijs bereiden en leg het monster in de hydrogel monomeer oplossing op ijs. Verzamelen van 2-3, 18-gauge injectienaalden per monster, paraffine film en een timer. Sluit de slang aan de stikstof tank zodat de stikstof kan stromen. Terwijl het monster op ijs, zorgvuldig doorboren het GLB van een conische buis met het monster aan de ene kant en druk op een hypodermic naald door totdat het is onder het oppervlak van de vloeibare monomeer-oplossing. Een ander hypodermische naald gebruiken om het doorprikken van de overkant van het GLB, maar niet toestaan om te worden ondergedompeld.Opmerking: De tweede naald zal de buis vent. Sluit de slang van de stikstof tank aan de hypodermische naald ondergedompeld onder de hydrogel en langzaam draai op de stikstof totdat het kolkt gestaag door middel van de vloeistof. Toestaan dat de stikstof bubble via de vloeistof gedurende 10 minuten. Zodra de zuurstof is verwijderd, snel verwijderen van beide naalden en dekking van het GLB met een paraffine-film om te voorkomen dat elke verdere uitwisseling van gassen tussen buis en het milieu. Leg het ontgaste monster in een incubator bij 37 ° C gedurende 3 uur te polymeriseren de hydrogel. 6. de weefsels Clearing Het bereiden van 500 mL oplossing (4% SDS bij pH 8,5) wissen. Voeg 50 mL 0,1 M PBS en 20 g SDS poeder al roerend met een magnetische roer bar ~ 300 ml ddH2O. De oplossing met behulp van natriumhydroxide en zoutzuur aan pH 8,5 aanpassen. Voeg ddH2O totdat het eindvolume 500 mL is. Na polymerisatie, giet weg overtollige hydrogel en gooi het in een chemisch afval container. Gebruik een papieren handdoek om voorzichtig vegen weg hydrogel uit het monster en gooi deze weg in een chemisch afval container. Wassen van het monster in 3-5 uitwisseling van 0,01 M PBS (discard wassen vloeistof in de chemische afvalstoffen) gedurende 15 minuten elke stap wassen. Breng het monster in een conische buis van 50 mL met 40 mL buffer clearing. Incubeer het monster in de buffer clearing bij 37 ° C en omzetten in monster verse clearing buffer om de andere dag. Laat het monster in de buffer clearing voor 2-8 weken afhankelijk van de grootte van de steekproef (~ 8 weken voor een 3 x 3 mm x 3 mm monster) om ervoor te zorgen de juiste clearing. Controleert van weefsel clearing en stopt wanneer voltooid. Zorgen dat de steekproef voldoende transparant door het bedrijf tegen het licht om te controleren voor de juiste clearing (meestal enkele bruin kleuren blijft in de exocrine regio’s).Opmerking: Een overdreven gewiste monster zal verschijnen versleten op de randen en de textuur zullen zeer zacht toen pakte met een tang. Het is gebruikelijk dat het monster, tot duidelijk ongelijk. Ook zal het weefsel niet volledig transparant totdat geplaatst in montage media (invoegen, Figuur 1 c). 7. meerdere immunofluorescentie Wassen van de monsters op een shaker op 60 rpm op RT voor één dag met 40 mL 0,01 M PBS omzetten in verse buffer vaak (4-5 buffer veranderingen in totaal, 40 mL elke wassen, elke h veranderen tot het uiteindelijke wassen). Laat de laatste wasbeurt blijven ‘s nachts op RT. PACT kleuring buffer voor te bereiden. Toevoegen aan 500 mL 0,01 M PBS, natriumazide 50 mg en 0,5 mL TritonX-100. Meng goed. Incubeer het monster met primaire antilichamen. 2% normale serum (dezelfde soort als het secundaire antilichaam) toevoegen aan de basis PACT kleuring buffer in een 2-mL vlakke onderkant-buis (ten minste 1 mL totale volume wordt aanbevolen per monster/buis). Primair antilichaam aan de 2% serum/PACT kleuring buffer toevoegen. Gebruik ongeveer 5 x de hoeveelheid primair antilichaam voor het PACT kleuring zoals zou worden gebruikt voor standaard immunohistochemistry (dat wil zeggen als een antilichaam verdunde 1:500 voor standaard immunohistochemistry, gebruik 1:100 voor het PACT kleuring). Gebruik een spatel om het monster te verwijderen uit de buffer wassen en schar de overtollige buffer af naar een papieren handdoek, dan plaatst u in de buis met een primair antilichaam-oplossing. 2-4 dagen bij RT op een shaker op 60 rpm uit te broeden. Monsters grondig wassen op RT op een shaker op 60 rpm in 0,01 M PBS omzetten in verse buffer 4 – 5 keer en het verlaten van de definitieve wassen op overnachten zoals in stap 7.1. Incubeer monsters met secundaire antilichamen. 2% normale serum (dezelfde soort als het secundaire antilichaam) toevoegen aan de basis PACT kleuring buffer in een 2-mL vlakke onderkant-buis (1 mL totale volume wordt aanbevolen per monster/buis). Voeg de secundaire antilichamen bij een concentratie van 1:200 (5 µl in 1 mL buffer).Opmerking: Klein formaat antilichamen zijn voorkeur, evenals zeer cross-geadsorbeerde antilichamen als meer dan één primaire antilichaam gebruikt. Gebruik een spatel om het monster uit was buffer verwijderen en schar de overtollige buffer af naar een papieren handdoek, dan plaatst u in de buis met een secundair antilichaam-oplossing. Incubeer bij RT op een shaker op 60 rpm voor 2 dagen en het monster te beschermen tegen licht. De monsters grondig wassen, zoals in stap 7.1, op RT op een shaker op 60 rpm in 0,01 M PBS wijzigen aan de verse buffer 4 – 5 keer en het verlaten van de finale was ‘s nachts, beschermen tegen licht tijdens wasbeurten. 8. montage monsters voor Imaging Bereiden de brekingsindex gecompenseerde oplossing (velgen) buffer. Weeg 11 g niet-ionogene dichtheid kleurovergang medium (bijvoorbeeld Histodenz) en zorgvuldig overbrengen in een conische buis van 50 mL. Voeg ~ 5 mL 0,02 M fosfaat buffer (PB)8 met behulp van een spatel om lucht uit het poeder niet-ionogene dichtheid kleurovergang medium vrij te geven.Opmerking: De oplossing zal zeer viskeuze, meng goed. Breng het volume tot 10 mL met behulp van meer PB, meng met een spatel en schrapen de overschrijding van de spatel in de buis. VELGEN Incubeer bij 37 ° C tot het is opgelost, omkeren en meng voorzichtig zo nodig. Pipetteer monsters in velgen. Pipetteer 1 mL velgen in een 2-mL flat-onderkant-buis om dit te doen. Gebruik een spatel om het monster uit was buffer verwijderen en schar de overtollige buffer af naar een papieren handdoek, dan plaatst u in de buis met velgen oplossing. Tik zachtjes op de buis om te dompelen van het monster in de velgen. Leg monsters in velgen op de bank beschermd tegen licht op RT voor 2-4 dagen vóór de beeldvorming. Plaats een kleine hoeveelheid van de velgen in een 8-well dekglaasje aan onderste kamer dia naar image. Alleen het toevoegen van net genoeg om jas van de bodem, meer zal leiden tot het monster te zweven, waardoor het moeilijker om het imago op een omgekeerde scope. Voeg het monster naar de waterput en de dia voor beeldvorming van het GLB. 9. imaging Confocal Microscopie en beeldbewerkingssoftware Selecteer de passende lasers voor de excitatie en emissie spectra van de fluorophores gebruikt om het PACT monsters vlek. Pas de instellingen van de acquisitie software zodat overlappingen tussen kanalen wordt geëlimineerd. Gebruik afzonderlijke tracks indien nodig (wanneer twee fluorophores soortgelijke excitatie spectra hebben). Instellen van de Beeldacquisitie Kiezen van de verwerving van de maximale snelheid, 16-bits, 4 of meer gemiddelden en resolutie 1024 x 1024 of beter. Inzoomen op het object dat moet worden beeld.Opmerking: Dit zal dalen Acquisitietijd te verminderen foto-bleken en ook verkleinen van bestandsgrootte en downstream bewerken. Instellen van de z-stack. Selecteer de optimale segmenteren voor het doel wordt gebruikt. Als deconvolutie later gewenst is, gebruikt u een z-stap kleiner dan optimale zoals 1 µm. Gebruik de z-stack-correctie. Dichtst bij het oppervlak van het weefsel begint en verhoging van de winst als de doelstelling richt zich door middel van het z-vlak en correcties toevoegen. Wijzig niet de instellingen van de laser voor de correctie! Verwerven van een stapel van de test met een gemiddelde resolutie van 512 x 512 en verwerving van de maximale snelheid. Controleer het beeld in 3D om ervoor te zorgen dat er gelijke helderheid in de stack voor elke kleur is alvorens de definitieve hoge resolutie z-stack te verkrijgen. Lightsheet Imaging Ervoor zorgen dat de monsters hebben zijn geëquilibreerd in velgen voor imaging voor ten minste 24 h. ideaal, overbrengen van de monsters naar verse velgen in de beeldvorming zaal en laat in de zaal equilibreer gedurende ten minste een dag. Monteren van het monster voor imaging Selecteer de kleinste (zwart) capillair te monteren van het monster Gebruik putty of een schotel te houden van het monster tijdens het toepassen van superlijm aan het einde van het capillair. Lijm het weefsel naar het capillair aan een oppervlak van het weefsel mogelijk zo weinig te raken. Voeg het monster voor imaging. Beeld met behulp van 5 X of 25 X doelstellingen geschikt voor optisch gewiste monsters met behulp van het scharnierpunt scan optie. Als schaduwen of vervagen optreedt, roteren van het monster en probeer het opnieuw of laat het monster blijven equilibreer in velgen.Opmerking: Een stapel 1 mm kan over het algemeen worden verworven in minder dan vijf minuten, afhankelijk van de instellingen. Bekijken en bewerken van de afbeeldingsstapels met behulp van de software van de analyse van de afbeelding.