İnsan pankreas nöro-ada ağının yüksek çözünürlükte 3D görüntüleme

Tüm deneyler Florida Üniversitesi Kurumsal değerlendirme Komitesi ve Federal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Dikkat: Paraformaldehyde ve Akrilamid toksik tahriş edici vardır. Reaktifler bir duman başlıklı uygun kişisel koruyucu ekipman (önlük, eldiven, göz koruması) ile başa. 1. deparaffinization formaldehit sabit dokuların (Eğer taze dokular ile çalışma, 2. adıma atlayın) Yeni jilet veya neşter parafin ile doku yüzeyine dik kesmek için kullanın. Parafin bu gevşeme bitirmek için doku arasındaki sınırda kesti. Forseps veya bir spatula nazikçe gevşetin ve optik temizlenecek doku kaldırmak için kullanın. Yavaşça bir spatula (şekil 1A) kullanarak dokusundan fazla parafin kazı. Bir cam kaba Ksilen (yaklaşık 30 mL 3 x 3 x 3 mm bölüm doku için) ile doldurun ve 24 saat oda sıcaklığında (RT) için bu çözüm dokusunda kuluçkaya. Başka bir cam kaba 1.2.1 aynı birimle taze Ksilen ile doldurun. Aktarım ve RT. 24 h için bu çözüm dokusunda kuluçkaya % 100 etanol 1.2.1 aynı birimle konik bir tüp içine koyun. Aktarım ve RT. 24 h için bu çözüm dokusunda kuluçkaya % 95 etanol 1.2.1 aynı birimle konik bir tüp içine koyun. Aktarım ve RT. 24 h için bu çözüm dokusunda kuluçkaya % 70 etanol 1.2.1 aynı birimle konik bir tüp içine koyun. Aktarım ve RT. 24 h için bu çözüm dokusunda kuluçkaya Durulama 0.01 M fosfat dokusunda tamponlu tuz (PBS) ve doku parafin (şekil 1B, doğru kapı aynası) ücretsizdir RT. emin olun, 24 h için equilibrate için 0,01 M PBS konik tüp içinde bir yerde. 2. % 4 Paraformaldehyde (PFA) sabitleştirici hazırlayın 10 mL % 16 pipet PFA 50 mL konik tüp içine 4 mL 0.1 M PBS ekleyin ve 26 mL distile deiyonize su (GKD2O) ekleyin. Kapağı kapatın ve kısa bir süre karıştırın. % 4 daha büyük birimleri PFA devam et ve dondurulmuş aliquots içinde yapılabilir. Aliquots 4 ° C’de bir hafta ve 1 ay-20 ° C’de (RT), oda sıcaklığında 1 gün için iyi 3. pankreas fiksasyon Pankreas örnek (≤ 1 x 1 x 2 cm) taze hazırlanmış %4 oranında tamir PFA 48 saat için 4 ° C’de. Örnek 1 x 1 x 2 cm, içine daha küçük incelemek için bir bistüri veya jilet kullanın daha büyük ise en fazla 1 cm kalınlığında parçalar. Doku örneği üç değişiklikleri 0,01 M PBS için en az 15 dk içinde her yıkama yıkama ve 15 mL santrifüj tüpü % 0,01 PFA/0,01 M PBS ya da % 0.5 sodyum azid/0,01 M PBS kadar kullanmak saklayın. Fiksasyon sonra doku işlenmesi için 1-2 mm kalınlığında bölümlere bölüm. Bir vibratome bile kesit yardımcı olması için kullanın.Not: Son bölüm başlangıç örnek boyutu üzerinde bağlıdır. 4. embed doku hidrojel içinde 200 mL % %4 Akrilamid/1 paraformaldehyde (A4P1) hidrojel monomer çözeltisi şekilde hazırlayın: Bir şişe buz bir kova bir manyetik heyecan plaka üstüne yerleştirin. Şişeye düz oturuyor emin olun ve bir manyetik heyecan çubuğu ekleyin. Aşağıdaki sırayla ekleyin: 147.8 mL soğuk (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0.1 M PBS, 20 mL soğuk (4-8 ° C) % 40 Akrilamid çözüm, 12.2 mL % 16 PFA çözüm ve 250 mg VA-044 başlatıcı. En az 10 dakika için bir manyetik heyecan çizgiyle tüm hidrojel çözüm mix ve buz sonraki adım için çözüm bırakmaktır. 15 mL konik tüp buz yanında hidrojel solüsyon içeren şişeye koyun. Monomer çözüm 14 mL tüp içine pipet ve 1-2 mm kalınlığında sabit doku örneği tek parça ekleyin. Sonra tüp kap. Monomer çözüm örnek 4 ° C’de 3 gün kuluçkaya ve ışıktan korumak. Aliquot kalan monomer çözüm ve mağaza-20 ° c ileride kullanmak için. 5. Monomer çözüm degas ve hidrojel polimerize Oksijen gaz halinde olan yakıtlar N28kullanarak hidrojel monomer çözümden kaldırmak. Bir kova dolusu buz hazırlamak ve hidrojel monomer çözüm buz üzerinde örnek yer. 2-3, 18’lik Hipodermik iğneler örnek, parafin film ve bir zamanlayıcı ücret toplamak. Tüp azot tankı bağlama azot akabilir. Örnek üzerinde buz tutarken dikkatli bir şekilde bir tarafta örnek içeren bir konik tüp kap işlemek ve sıvı monomer çözüm altında o kadar Hipodermik İğne yüzeydir 1’e basın. Başka bir şırınga iğnesi kap karşı tarafına ponksiyon için kullanın, ama su altında olmak izin vermez.Not: İkinci iğne tüp delik. Tüp hidrojel altında batık Hipodermik İğne azot tankından bağlanabilir ve sürekli sıvı ile köpüren kadar yavaş azot üzerinde döner. 10 dk için sıvı ile kabarcık azot sağlar. Oksijen kaldırılır bir kez hızlı bir şekilde her iki iğne kaldırmak ve gazlar tüp ve çevre arasında daha fazla herhangi bir değişimi önlemek için bir parafin film kapaklı kapağı. Degassed örnek bir kuluçka hidrojel polimerize 3 h için 37 ° C’de yerleştirin. 6. doku takas 500 mL çözüm (pH %8,5 4 SDS) temizleyerek hazırlayın. GKD2O ~ 300 mL için 50 mL 0.1 M PBS ve 20 g SDS toz karıştırma bir manyetik heyecan çizgiyle süre ekleyin. Sodyum hidroksit ve hidroklorik asit pH 8,5 için kullanarak çözüm ayarlayın. Son hacim 500 mL kadar GKD2O ekleyin. Polimerizasyon sonra uzak aşırı hidrojel dökün ve bir kimyasal atık konteyner içine atın. Yavaşça örnekten uzak hidrojel silin ve bir kimyasal atık konteyner içine atmak için kağıt havlu kullanın. Örnek 3-5 değişimleri 0.01 m PBS (at yıkama sıvısı içine kimyasal atık) 15 dakika her yıkama adım yıkayın. Örnek arabellek açıklığın 40 mL ile 50 mL konik tüp içine aktarın. Örnek 37 ° C’de takas arabellekte kuluçkaya ve örnek taze takas arabelleğe her gün değiştirin. Örnek uygun takas emin olmak için örnek boyutu (~ 8 hafta 3 mm x 3 mm x 3 mm örnek için) bağlı olarak 2-8 hafta boyunca takas arabellekte bırakın. Doku takas izleneceğini ve tamamlandığında. Uygun takas için kontrol etmek için ışığa tutarak örnek yeterince şeffaf olduğundan emin olun (genellikle bazı tan boyama ekzokrin bölgelerde devam edecek).Not: Aşırı temizlenmiş bir örnek kenarlarında yıpranmış görünür ve doku Forseps ile elime aldığımda çok yumuşak olacak. Düzensiz temizlemek örnek için yaygındır. Ayrıca, doku kadar (INSERT, şekil 1 c) ortam takma yerleştirilir tamamen saydam olmayacaktır. 7. birden çok ayirt Bir shaker 60 RPM üzerinde örnekleri RT bir günlüğüne taze arabelleğine kez (4-5 tampon, toplam 40 mL her h son yıkama kadar değişen her yıkama değiştirir) değişen 40 mL 0.01 M PBS yıkayın. Gecede RT. devam son yıkama izin Arabellek boyama PAKTI hazırlayın. 500 mL 0.01 M PBS için 50 mg sodyum azid ve 0.5 mL TritonX-100 ekleyin. İyice karıştırın. Örnek birincil antikorlar ile kuluçkaya. 2-mL düz dipli tüp arabellekte boyama temel PAKTI % 2 normal serum (aynı tür ikincil antikor olarak) eklemek (en az 1 mL Toplam hacim örnek/tüp önerilir). Birincil antikor % 2 serum/tampon boyama PAKTI için ekleyin. (Yani bir antikor için standart immünhistokimya, PAKTI boyama için kullanım 1: 100 seyreltilmiş 1:500 ise) için standart immünhistokimya derdi gibi yaklaşık 5 x birincil antikor miktarı PAKTI boyama için kullanın. Bir spatula örnek yıkama arabelleğinden kaldırın ve kağıt havlu üzerine kapalı aşırı arabellek dab sonra birincil antikor çözüm ile tüp yerleştirmek için kullanın. RT bir shaker 60 RPM üzerinde 2-4 gün kuluçkaya. Örnekleri RT bir shaker 60 RPM taze arabelleğe 4 – 5 kez değişen ve son yıkama gecede adım 7.1 olduğu gibi bırakarak 0.01 M PBS üzerinde iyice yıkayın. Örnekleri ikincil antikorlar ile kuluçkaya. 2-mL düz dipli tüp arabellekte boyama temel PAKTI % 2 normal serum (aynı tür ikincil antikor olarak) eklemek (örnek/tüp 1 mL Toplam hacim tavsiye edilir). İkincil antikorlar (1 mL arabelleği 5 µl) 1: 200 bir konsantrasyon ekleyin.Not: Küçük format antikorlar tercih, aynı zamanda son derece çapraz adsorbe antikorlar birden fazla birincil antikor kullanıyorsanız geçerlidir. Bir spatula örnek yıkama arabelleğinden kaldırın ve kağıt havlu üzerine kapalı aşırı arabellek dab sonra ikincil antikor çözüm ile tüp yerleştirmek için kullanın. Bir shaker 60 RPM üzerinde RT, 2 gün kuluçkaya ve örnek ışıktan korumak. Örnekleri iyice yıkayın, RT bir shaker 60 RPM taze arabelleğe 4 – 5 kez değişen ve final bırakarak 0.01 M PBS üzerinde 7.1, adımda olduğu gibi gece yıkama, ışıktan yıkama sırasında korumak. 8. montaj örnekleri görüntüleme için Kırılma indisi eşleşen çözüm (jant) arabellek hazırlayın. Non-iyonik yoğunluk gradient orta (örneğin, Histodenz) 11 g tartmak ve dikkatle 50 mL konik tüp aktarın. ~ 5 mL 0,02 M fosfat tampon (PB)8 toz non-iyonik yoğunluk gradient orta hava serbest bırakmak için bir spatula kullanarak ekleyin.Not: Çözüm çok viskoz, iyice karıştırın. 10 mL daha fazla PB kullanarak ses getirmek, bir spatula ile karıştırın ve tüpün içine aşırı spatula kapalı kazımak. JANTLAR eriyene kadar 37 ° C de kuluçkaya, ters çevir ve karışımı yavaşça gerektiği gibi. Örnekleri jantlar aktarın. Bunu yapmak için 2-mL düz-alt tüpüne pipet 1 mL jantlar. Bir spatula örnek yıkama arabelleğinden kaldırın ve kağıt havlu üzerine kapalı aşırı arabellek dab sonra jantlar çözüm ile tüp yerleştirmek için kullanın. JANTLAR örnekte daldırın tüpü hafifçe dokunun. Örnek 2-4 gün önce görüntüleme için RT ışıkta korunuyorsunuz bankta jantlar yerleştirin. Görüntü için jantlar küçük bir miktar bir 8-şey coverslip alt odası slayt içine yerleştirin. Daha fazla örnek üzerinde ters bir kapsamı görüntü daha zorlaştırır float neden olur, sadece yeterli alt kat için ekleyin. Örnek kuyuya Ekle ve slayt görüntüleme için kap. 9. görüntüleme Confocal mikroskobu ve düşsel bilgisayar yazılımı Uyarma ve PAKTI örnekleri leke için kullanılan fluorophores salma spectra için uygun lazerler seçin. Kanallar arasında herhangi bir çakışma ortadan edinme yazılım ayarlarını ayarlayın. (İki fluorophores benzer uyarma spectra) ayrı parça gerekiyorsa kullanın. Resim alma ayarla Maksimum edinme hız, 16 bit, 4 veya daha fazla ortalamalar ve 1024 x 1024 çözünürlük seçin ya da daha iyi. Yansıması için nesnesine zoom.Not: Bu fotoğraf beyazlatma azaltmak ve ayrıca dosya boyutu ve karşıdan akış düzenleme azaltmak için satın alma zaman azaltacaktır. Z-yığın Kur. Kullanılan amaç için en uygun kesit seçin. Deconvolution daha sonra isterseniz bir z-adım en uygun 1 µm gibi daha küçük kullanın. Z-yığın düzeltme kullanın. Doku yüzeyine en yakın başlamak ve amaç z uçağın odaklanır kazancı artar ve düzeltmeleri ekleyin. Düzeltme için lazer ayarlarını değiştirmeyin! Bir ortalama, 512 x 512 çözünürlük ve maksimum edinme hız testi yığınıyla elde etmek. Görüntü 3D son yüksek çözünürlüklü z-yığın alınıyor önce her renk için yığını boyunca eşit parlaklık olduğundan emin olmak için denetleyin. Lightsheet görüntüleme Örnekleri jantlar en az 24 h için ideal görüntüleme için equilibrated, görüntüleme odasında taze jantlar için örnekler aktarmak ve odasında equilibrate için en az bir gün için izin emin olun. Görüntüleme için örnek monte Örnek takmak için en küçük (siyah) kılcal seçin Macun veya bir tabak kılcal damar sonuna kadar süper yapıştırıcı uygulanırken örnek tutmak için kullanın. Küçük mümkün olduğunca doku yüzeyine dokunmadan kılcal için doku yapıştırıcı. Görüntüleme için örnek ekleyin. Resim 5 X veya 25 X hedeflerine uygun optik temizlenen örnekleri pivot kullanarak seçeneği tarama kullanarak. Gölgeleme veya bulanıklık ortaya çıkarsa, örnek döndürme ve yeniden deneyin veya jantlar equilibrate devam örnek izin.Not: 1 mm yığını genellikle az beş dakika ayarlarına bağlı olarak elde edilebilir. Görüntüleyin ve görüntü analiz yazılımı kullanarak görüntü yığınları düzenleyin.