ひと膵臓の神経島国的なネットワークの高解像度の 3 D イメージング

フロリダ大学治験審査委員会と連邦政府のガイドラインに従ってすべての実験を行った。 注意: パラホルムアルデヒド、アクリルアミドは、有害刺激です。適切な個人用保護具 (白衣、手袋、眼の保護) と発煙のフードで試薬を処理します。 1. ホルマリン固定組織の deparaffinization (新鮮な組織で作業する場合は手順 2 に進みます) 新しいかみそりの刃やメスを使用して、組織の表面に垂直なパラフィンをカットします。それを緩めるまで組織の端にパラフィンをカットします。軽く緩めてをクリアする光学的組織を削除する鉗子やヘラを使用します。へら (図 1 a) を使用して組織から余分なパラフィンを優しくこすり取る。 キシレン (組織部 3 mm x 3 x 3 約 30 mL) でガラス容器を満たし、室温 (RT) で 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい。 1.2.1 と同じボリュームと新鮮なキシレンで別のガラス容器を満たしなさい。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい 1.2.1 と同じボリュームでの円錐管に 100% エタノールを配置します。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい 1.2.1 と同じボリュームでの円錐管に 95% エタノールを配置します。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい 1.2.1 と同じボリュームでの円錐管に 70% エタノールを配置します。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい リンスで 0.01 M リン酸組織緩衝生理食塩水 (PBS) と組織、パラフィン (図 1 b、右側のパネル) がしたことを確認、24 時間平衡に円錐管で 0.01 M の PBS の場所。 2. 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の定着剤を準備します。 16 mL のピペット 50 mL の円錐管に PFA 4 mL 0.1 M PBS を追加し、26 mL 脱イオン蒸留水 (ddH2O) を追加。キャップを閉じるし、一時的に混ぜます。 4% の大量先行と因数で冷凍は、PFA が行うことができます。4 ° C で 1 週間、-20 ° C で 1 ヶ月、因数は室温 (RT) で 1 日良い 3. 膵臓固定 作りたての 4% 膵臓サンプル (≤ 1 × 1 × 2 cm) を修正 48 h の 4 ° C で PFA。サンプルが 1 × 1 × 2 cm、小さいに解剖するメスや剃刀の刃を使用するよりも大きい場合は厚さが 1 cm 以上の部分します。少なくとも 15 分 0.01 M PBS の 3 つの変更で組織サンプル各洗浄を洗浄し、0.01 %pfa/0.01 M PBS または 0.5% ナトリウム アジ化/0.01 M PBS で 15 mL 遠心管に使用するまでを格納します。 固定後に、、さらなる処理のための 1-2 mm 厚いセクションに組織をセクションします。断面も支援するために、vibratome を使用します。注: セクションの最終的な数が開始のサンプルのサイズによって異なります。 4. ハイドロゲルにティッシュを埋め込む 次のとおりの 4% アクリルアミド/1% パラホルムアルデヒド (A4P1) ハイドロゲル モノマー溶液 200 mL を準備します。 電磁攪拌プレートの上にバケツに氷にフラスコを配置します。フラスコは平らに座っているかどうかを確認し、電磁攪拌棒を追加します。 順序で、次を追加: 250 mg VA 044 イニシエーター、12.2 mL 16 %pfa 溶液、20 mL 冷 (4-8 ° C) 40% アクリルアミド溶液 20 mL 0.1 M PBS 147.8 mL 冷たい (4-8 ° C) ddH2O。少なくとも 10 分のための磁気攪拌棒全体ハイドロゲル ソリューションをミックスし、次のステップのための氷にソリューションを残します。 15 mL コニカル管氷で横に配置ゲル溶液フラスコ。管にピペットのモノマー液 14 mL と 1-2 mm 厚固定ティッシュ サンプルの一枚を追加します。チューブをキャップします。 モノマー溶液サンプルをインキュベート 4 ° C で 3 日間、光から保護します。割り切れる任意の残りのモノマー ソリューションと将来の使用のための-20 ° C でストア。 5. ドガ モノマー ソリューションと、ゲルの重合 ガス N28を使用してゲル モノマー溶液から酸素を取り除きます。 氷のバケツを準備し、氷上ハイドロゲル モノマー溶液サンプルを配置します。 サンプル、パラフィンの膜、およびタイマーごと 2-3、18 ゲージ注射針を収集します。窒素タンクにチューブを接続し、窒素が流れることができるようにします。氷のサンプルを保ちながら慎重に 1 つの側面のサンプルを含む円錐管のキャップに穴を開けるし、それまでを通して注射針は液体モノマー溶液の表面の下を押します。 キャップの反対側を穿刺する別の注射針を使用、浸水になることはできません。注: 2 番目の針はチューブにはけ口をつけるでしょう。 ヒドロゲルの下に沈め注射針に窒素タンクからチューブを接続し、それが液体を着実にバブルまで窒素ゆっくりに入れます。 10 分の液体をバブルに窒素を許可します。 酸素を削除すると、すぐに両方の針を削除し、ガス管と環境の間の任意の一層の交流を防ぐためにパラフィン フィルムとキャップをカバーします。3 h、ゲルの重合を 37 ° C でインキュベーターで脱サンプルを配置します。 6. 組織クリア クリア ソリューション (ph 8.5 4 %sds) 500 mL を準備します。DdH2O の ~ 300 mL、電磁攪拌棒で攪拌しながら、50 mL の 0.1 M PBS と 20 g SDS 粉末を追加します。水酸化ナトリウムと塩酸 8.5 を使用してソリューションを調整します。最終巻が 500 mL になるまでは、ddH2O を追加します。 重合後余分なゲルを垂れ流し、化学廃棄物容器に捨てます。優しくサンプルから離れてハイドロゲルを一掃し、化学廃棄物容器に捨てる紙タオルを使用します。 0.01 M PBS の 3-5 交流 (化学廃棄物に捨てる洗浄液) のサンプル 15 分各洗浄ステップを洗います。バッファーをクリア 40 mL と 50 mL の円錐管にサンプルを転送します。 37 ° C でクリア バッファーにサンプルをインキュベートし、他の毎日新鮮なクリア バッファーにサンプルを変更します。 適切な決済を確保するためにサンプルのサイズ (3 mm × 3 mm × 3 mm サンプル 〜 8 週間) に応じて 2-8 週間のクリアリング バッファー内のサンプルをままにします。 組織の清算を監視し、完了を停止します。適切な決済を確認する光まで保持することによって、サンプルが十分に透明であることを確認 (通常いくつかの日焼け着色は外分泌腺領域で維持されます)。注: 過剰消去されたサンプルが端擦り切れ表示され、テクスチャーが鉗子で拾ったとき非常に柔らかくなります。均等にないをクリアするサンプルが一般的です。また、組織は完全に透明 (挿入、図 1) メディアのマウントに配置されるまでできません。 7. 複数の蛍光 40 mL 0.01 M PBS 新鮮なバッファー頻繁 (4-5 バッファー変更、合計 40 mL で洗うたび、最終的な洗浄まですべての時間を変更する) に変更すると RT で 1 日 60 rpm でシェーカーでサンプルを洗います。一晩室温に続ける最終的な洗浄をしましょう 協定染色バッファーを準備します。500 mL の 0.01 M PBS、アジ化ナトリウム 50 mg、0.5 mL TritonX 100 を追加します。よく混ぜます。 一次抗体とサンプルをインキュベートします。 2 mL 平底チューブ内のバッファーを染色基本協定に 2% 正常な血清 (二次抗体として同じ種) を追加 (サンプル/チューブあたり少なくとも 1 mL 容量を推奨)。 染色バッファー 2% 血清/協定に一次抗体を追加します。(つまり場合は、抗体はの標準的な免疫組織化学、協定の汚損のための使用 1: 100 希釈 1: 500) 標準的な免疫組織化学に使用できる協定の汚損のため約 5 x の一次抗体の量を使用します。 ヘラを使用すると、洗浄バッファーからサンプルを削除オフ紙タオルの上に余分なバッファーを軽くたたくと一次抗体溶液をチューブ内に配置します。 2-4 日 60 rpm でシェーカーの RT で孵化させなさい。0.01 M PBS 新鮮なバッファーを 4-5 回の変更手順 7.1 のように一晩で最終的な洗浄に出入りで 60 rpm でシェーカーの RT でサンプルを徹底的に洗います。 二次抗体のサンプルをインキュベートします。 2 mL 平底チューブ内のバッファーを染色基本協定に 2% 正常な血清 (二次抗体として同じ種) を追加 (サンプル/チューブあたり 1 mL 容量を推奨)。 1: 200 (1 mL バッファーで 5 μ l) の濃度で二次抗体を追加します。注: 複数の一次抗体を使用している場合、小さいフォーマットの抗体は最寄りと高いクロス吸着抗体です。 ヘラを使用すると、洗浄バッファーからサンプルを削除オフ紙タオルの上に余分なバッファーを軽くたたくと二次抗体溶液をチューブ内に配置します。 2 日間 60 rpm でシェーカーの RT でインキュベートし、光からサンプルを保護します。 サンプルを徹底的に洗って、一晩で洗う手順 7.1 では、新鮮なバッファーを 4-5 回の変更と決勝を残して 0.01 M PBS で 60 rpm でシェーカーで常温のように、洗浄中に光から守る。 8. 画像のサンプルを実装 屈折率整合ソリューション (リム) バッファーを準備します。 非イオン性の密度勾配媒体 (例えば、Histodenz) の 11 g を量りし、慎重に 50 mL の円錐管に転送します。 〜 5 mL 0.02 M リン酸バッファー (PB)8をへらを使用して粉体非イオン密度勾配媒体から空気を解放するを追加します。注: ソリューションは非常に粘りがある、よく混ぜます。 多くの鉛を使用して 10 の mL にボリュームをもたらす、ヘラで混ぜるし、チューブにヘラを過剰をこすり。 37 ° C 溶解するまでインキュベート リム、反転、優しく混ぜる必要に応じて。 リムにサンプルを転送します。これを行うには、1 mL をピペット 2 mL 平底チューブにリムします。ヘラを使用すると、洗浄バッファーからサンプルを削除オフ紙タオルの上に余分なバッファーを軽くたたくとリム ソリューションとチューブ内に配置します。 リムのサンプルが水没するチューブが軽きます。リムのイメージングの前に 2-4 日間常温の光から保護されてベンチにサンプルを配置します。 画像、8 ウェル coverslip 下部チャンバー スライドにリムの少量を配置します。だけだけで十分なコートの下を追加しよりフローティング逆スコープの画像がより困難にするサンプルの原因となります。井戸の中にサンプルを追加し、イメージング用スライド キャップします。 9。 画像 共焦点顕微鏡とイメージング ソフトウェア 使用協定サンプルを染色する蛍光物質の発光スペクトルの励起の適切なレーザーを選択します。チャンネル間のすべての重複が排除され、集録ソフトウェアの設定を調整します。(2 つ fluorophores が付いている同様の励起スペクトル) は、必要に応じて個別のトラックを使用します。 画像の取得を設定します。 最大集録速度、16 ビット、4 つ以上の平均値および 1024 × 1024 の解像度を選択するかより良い。 イメージを作成するオブジェクトをズームインします。注: これは写真漂白を削減し、ファイル サイズと下流編集減らすも集録時間を減らします。 Z スタックをセットアップします。 使用されている目的のために最適な断面を選択します。デコンボリューションは、後で必要な場合は、z ステップを 1 μ m など最適なより小さいの使用にします。 Z スタック補正を使用します。 組織の表面に最も近い開始目的を z 平面を通る焦点を当て、利得を上げるし、訂正を追加します。補正のためのレーザーの設定を変えてはいけない! 1 つの平均、512 x 512 の解像度、最大集録速度のテスト スタックを取得します。最終的な高解像度の z スタックを取得する前に各色のスタック全体で均一な輝度があることを確認する 3 D でイメージを確認します。 Lightsheet イメージング サンプルはイメージングの商工会議所で新鮮なリムにサンプルを転送、少なくとも 1 日の商工会議所で平衡することができること、理想的には、少なくとも 24 時間のイメージングのリムで平衡されているを確認します。 イメージングのサンプルをマウントします。 サンプルをマウントする最小 (黒) 毛細血管を選択します。 使用するパテまたは毛細血管の最後にスーパー接着剤を塗布しながらサンプルを保持するために料理します。少しとして可能な限り組織の表面に触れる毛細血管に組織を接着します。 イメージングのサンプルを挿入します。 5 X、25 X 目標適切なピボットを使用して光学的にクリアされたサンプル スキャン オプションを使用してイメージ。シャドウやぼかしが発生した場合、サンプルを回転やり直して、や続きをリムで平衡にサンプルを聞かせてください。注: 1 mm スタックは、設定によっては 5 分未満で一般的に取得できます。 表示および画像解析ソフトウェアを使用して画像のスタックを編集します。