Hochauflösende 3D Bildgebung des menschlichen Bauchspeicheldrüse Neuro-insularen Netzwerks

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der University of Florida Institutional Review Board und Richtlinien des Bundes durchgeführt. Achtung: Paraformaldehyd und Acrylamid sind giftige Reizstoffe. Reagenzien in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe, Augenschutz) zu behandeln. (1) 4.wenn der Formaldehyd-feste Gewebe (wenn mit frischem Gewebe arbeiten, überspringen Sie Schritt 2) Verwenden Sie eine neue Rasierklinge oder einem Skalpell durchtrennen das Paraffin senkrecht zur Oberfläche des Gewebes. Schneiden Sie das Paraffin an den Rand des Gewebes zu beenden, es zu lösen. Verwenden Sie Zange oder einem Spatel vorsichtig lösen und entfernen das Gewebe optisch gelöscht werden. Reiben Sie sanft überschüssiges Paraffin aus dem Gewebe mit einem Spatel (Abbildung 1A). Füllen Sie einen Glasbehälter mit Xylol (ca. 30 mL für ein 3 x 3 x 3 mm-Abschnitt des Gewebes) und inkubieren Sie das Gewebe in dieser Lösung für 24 h bei Raumtemperatur (RT). Füllen Sie ein weiteres Glas-Container mit frischen Xylol mit dem gleichen Volumen als 1.2.1. Übertragen und das Gewebe in dieser Lösung für 24 h bei RT inkubieren Setzen Sie 100 % Ethanol in einem konischen Rohr mit dem gleichen Volumen als 1.2.1. Übertragen und das Gewebe in dieser Lösung für 24 h bei RT inkubieren Platz 95 % Ethanol in einem konischen Rohr mit dem gleichen Volumen als 1.2.1. Übertragen und das Gewebe in dieser Lösung für 24 h bei RT inkubieren Legen Sie 70 % Ethanol in einem konischen Rohr mit dem gleichen Volumen als 1.2.1. Übertragen und das Gewebe in dieser Lösung für 24 h bei RT inkubieren Spülen Sie das Gewebe in 0,01 M Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Platz in 0,01 M PBS in einer konischen Röhre zu equilibrate 24 h bei RT. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe frei von Paraffin (Abbildung 1 b, rechts). 2. bereiten Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA) Fixativ Pipette 10 mL 16 % PFA in ein 50 mL konische Rohr 4 mL 0,1 M PBS und hinzufügen 26 mL destilliertem, entionisiertem Wasser (DdH2O). Schließen Sie den Deckel und kurz mixen. Größere Mengen von 4 % PFA voraus und gefroren in Aliquote erfolgen. Aliquote eignen sich für 1 Tag bei Raumtemperatur (RT), eine Woche bei 4 ° C und 1 Monat bei-20 ° C. 3. die Bauchspeicheldrüse Fixierung Fixieren die Bauchspeicheldrüse Probe (≤ 1 x 1 x 2 cm) in frisch zubereitete 4 % PFA bei 4 ° C für 48 h. Die Probe ist größer als 1 x 1 x 2 cm, einem Skalpell oder einer Rasierklinge verwenden, um in kleineren sezieren Stücke nicht mehr als 1 cm dick. Gewebeprobe in drei Änderungen von 0,01 M PBS mindestens 15 min lang zu jedem Waschgang waschen und Lagern in 15 mL Zentrifugenröhrchen in 0,01 % PFA/0,01 M PBS oder 0,5 % Natrium-Azid/0,01 M PBS bis zur Verwendung. Nach der Fixierung Abschnitt des Gewebes in 1-2 mm dicke Schichten für die Weiterverarbeitung. Verwenden Sie eine Vibratome, bei der sogar schneiden.Hinweis: Die endgültige Anzahl der Abschnitte hängt von der Größe der Stichprobe ab. (4) Gewebe in Hydrogel einbetten 200 mL 4 % Acrylamid/1 % Paraformaldehyd (A4P1) Hydrogel Monomer Lösung wie folgt vorbereiten: Platzieren Sie ein Fläschchen auf dem Eis in einem Eimer auf der Oberseite eine magnetische rühren-Platte. Stellen Sie sicher, dass der Kolben flach sitzt, und fügen Sie eine magnetische Stir Bar. Fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge: 147,8 mL kalten (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0,1 M PBS, 20 mL kalten (4-8 ° C) 40 % Acrylamid-Lösung, 12,2 mL 16 % PFA Lösung und 250 mg VA-044-Initiator. Mischen Sie die gesamte Hydrogel-Lösung mit einer magnetischen Stir Bar mindestens 10 min lang und lassen Sie die Lösung auf dem Eis für den nächsten Schritt. Legen Sie eine 15 mL konische Rohr in das Eis neben der Küvette mit der Hydrogel-Lösung. Pipette 14 mL Monomer-Lösung in das Rohr und fügen Sie ein Stück von 1-2 mm dicken festen Gewebeprobe. Dann Röhrchen Sie das. Inkubation der Probe im Monomer Lösung für 3 Tage bei 4 ° C und vor Licht schützen. Aliquoten alle verbleibenden Monomer Lösung und bei-20 ° C für eine spätere Verwendung speichern. (5) Entgasen der Monomer-Lösung und polymerisieren Hydrogel Die Hydrogel-Monomer-Lösung mit gasförmigen N28entziehen Sie Sauerstoff. Bereiten Sie einen Eimer mit Eis und legen Sie die Probe in der Hydrogel-Monomer-Lösung auf dem Eis. Sammeln Sie 2-3, 18-Gauge Injektionsnadeln pro Sample, Paraffin-Film und ein Timer. Verbinden Sie den Schlauch mit der Stickstofftank, so dass der Stickstoff fließen kann. Halten Sie die Probe auf dem Eis und durchbohren Sie sorgfältig die Kappe einer konischen Röhre mit der Probe auf der einen Seite und drücken Sie eine subkutane Nadel durch bis es unter der Oberfläche der flüssige Monomer-Lösung ist. Verwenden Sie eine andere Injektionsnadel auf um die gegenüberliegende Seite der GAP zu durchbohren, aber es getaucht werden darf nicht.Hinweis: Die zweite Nadel wird den Schlauch entlüften. Verbinden Sie den Schlauch aus dem Stickstofftank mit der Injektionsnadel unter Wasser unter das Hydrogel und drehen Sie langsam auf den Stickstoff, bis es stetig durch die Flüssigkeit sprudeln wird. Lassen Sie den Stickstoff durch die Flüssigkeit für 10 min Blasen wirft. Nach dem Entfernen des Sauerstoffs schnell entfernen beide Nadeln und Abdeckkappe mit einem Paraffin-Film, weiteren Austausch von Gasen zwischen dem Rohr und der Umwelt zu verhindern. Legen Sie die entgast Probe in einem Inkubator bei 37 ° C für 3 h das Hydrogel polymerisieren. (6) Gewebe Clearing Bereiten Sie 500 mL clearing-Lösung (4 % SDS bei pH 8,5). ~ 300 mL DdH2O fügen Sie 50 mL 0,1 M PBS und 20 g SDS Pulver unter Rühren mit einem magnetischen Rühren hinzu. Passen Sie die Lösung mit Natronlauge und Salzsäure auf pH 8,5. Fügen Sie DdH2O hinzu, bis das endgültige Volumen 500 mL ist. Nach der Polymerisation überschüssige Hydrogel wegschütten und in einen chemischen Abfallbehälter entsorgen. Verwenden Sie ein Papiertuch sanft abwischen entfernt Hydrogel aus der Probe und in einen chemischen Abfallbehälter entsorgen. Waschen Sie der Probe in 3-5 Austausch von 0,01 M PBS (verwerfen waschen Flüssigkeit in die chemische Abfälle) für 15 min jedem Waschschritt. Übertragen Sie die Probe in ein 50 mL konische Röhrchen mit 40 mL Puffer löschen. Inkubieren Sie die Probe im Clearing Puffer bei 37 ° C und ändern Sie Probe in frischen Clearing Puffer jeden zweiten Tag. Lassen Sie die Probe im Clearing-Puffer für 2 bis 8 Wochen je nach Größe der Stichprobe (~ 8 Wochen für eine 3 x 3 mm x 3 mm Probe) dafür richtige Clearing. Überwachen Sie Gewebe-Clearing zu und beenden Sie, wenn Sie fertig sind. Sicherzustellen, dass die Stichprobe hinreichend transparent ist, durch hielt es gegen das Licht, für einen entsprechenden Ausgleich zu überprüfen (in der Regel einige Tan Färbung bleibt in den exokrinen Regionen).Hinweis: Eine über geräumte Probe erscheint an den Rändern ausgefranst und die Textur sehr weich, wenn mit der Pinzette abgeholt werden. Es ist üblich, dass die Probe um ungleichmäßig zu löschen. Die Gewebe werden auch nicht vollständig transparent bis platziert in der Montage von Medien (Insert, Abbildung 1). 7. mehrere Immunfluoreszenz Waschen Sie die Proben auf einem Schüttler bei 60 u/min bei RT für einen Tag mit 40 mL 0,01 M PBS Wechsel zu frischen Puffer oft (4-5 Puffer ändert in insgesamt 40 mL jedem Wechsel jede Uhr bis der letzte Wäsche waschen). Lassen Sie die letzte Wäsche über Nacht bei RT weiter Bereiten Sie Pakt Färbung Puffer. 500 mL 0,01 M PBS fügen Sie hinzu, 50 mg Natriumazid und 0,5 mL TritonX-100. Mischen Sie gut. Inkubation der Probe mit primären Antikörper. Der Basis Pakt Färbung Puffer in einer flachen Boden 2-mL-Tube 2 % normalen Serum (Artgenossen als sekundäre Antikörper) hinzufügen (mindestens 1 mL Gesamtvolumen pro Probenröhrchen/empfohlen). Die 2 % Serum/Pakt Färbung Puffer fügen Sie Primärantikörper hinzu. Verwenden Sie ca. 5 x die Menge der Primärantikörper für Pakt Färbung, wie für standard Immunohistochemistry verwendet werden würde, (d.h. wenn ein Antikörper verdünnt 1: 500 für standard Immunohistochemistry, Einsatz 1: 100 für Pakt Färbung ist). Entfernen die Probe aus der Waschpuffer und den überschüssigen Puffer auf ein Papiertuch abtupfen, dann legen Sie in das Rohr mit einer primären Antikörper-Lösung mit einem Spatel. Inkubieren Sie 2-4 Tage bei RT auf einen Shaker bei 60 u/min. Waschen Sie Proben bei RT auf einen Shaker bei 60 u/min in 0,01 M PBS in frischen Puffer 4 – 5 Mal ändern und verlassen die letzten Waschen über Nacht wie in Schritt 7.1 gründlich. Inkubieren Sie Proben mit Sekundärantikörper. Der Basis Pakt Färbung Puffer in einer flachen Boden 2-mL-Tube 2 % normalen Serum (Artgenossen als sekundäre Antikörper) hinzufügen (1 mL Gesamtvolumen pro Probenröhrchen/empfohlen). Fügen Sie sekundäre Antikörper in einer Konzentration von 1: 200 (5 µl in 1 mL Puffer).Hinweis: Kleinformat Antikörper sind bevorzugt, als auch hoch Kreuz adsorbiert Antikörper, wenn mehr als eine primäre Antikörper zu verwenden. Waschpuffer Probe entnehmen und den überschüssigen Puffer auf ein Papiertuch abtupfen, dann legen Sie in das Rohr mit einer sekundären Antikörperlösung mit einem Spatel. 2 Tage bei RT auf einen Shaker bei 60 u/min inkubieren und die Probe vor Licht schützen. Waschen Sie die Proben, wie in Schritt 7.1, bei RT auf einen Shaker bei 60 u/min in 0,01 M PBS ändern auf den frischen Puffer 4 – 5 Mal und verlassen das Finale waschen Sie, über Nacht, während Waschungen vor Licht schützen. 8. Montage Proben für die Bildgebung Bereiten Sie den Brechungsindex abgestimmte Lösung (RIMS) Puffer. Wiegen Sie 11 g nichtionischen Dichte Gradienten Medium (z. B. Histodenz) und übertragen Sie sorgfältig auf eine 50 mL konische Rohr. Fügen Sie ~ 5 mL 0,02 M Phosphat-Puffer (PB)8 mit einem Spatel um Luft aus dem Pulver nichtionischen Dichte Gradienten Medium lösen.Hinweis: Die Lösung ist sehr zähflüssig, gut mischen. Bringen Sie die Lautstärke auf 10 mL mit mehr PB mit einem Spatel mischen Sie und kratzen Sie den Überschuss aus dem Spatel in die Röhre. Brüten Sie Felgen bei 37 ° C bis aufgelöst, umkehren Sie und mischen Sie vorsichtig, je nach Bedarf. Übertragen Sie Proben in Felgen. Dazu 1 mL Felgen pipette in ein 2-mL-flach-Boden-Rohr. Einem Spatel Waschpuffer Probe entnehmen und den überschüssigen Puffer auf ein Papiertuch abtupfen, dann in der Röhre mit Felgen-Lösung. Klopfen Sie leicht das Rohr zur Probe in Felgen zu tauchen. Legen Sie Proben in Felgen auf der Bank lichtgeschützt bei RT für 2 bis 4 Tage vor der Bildgebung. Um Bild, legen Sie eine kleine Menge von Felgen in einer 8-Brunnen Deckglas unteren Kammer Folie. Nur fügen Sie gerade genug, um den unteren Mantel, mehr wird dazu führen, dass die Probe zu schweben auf einen umgekehrten Bereich Bild erschwert. Fügen Sie die Probe zum Brunnen und Kappe der Folie für die Bildgebung. (9) Bildgebung Konfokale Mikroskopie und imaging-software Wählen Sie geeignete Laser für die Erregung und Emissionsspektren von der Fluorophore verwendet, um den Pakt Proben zu beflecken. Passen Sie die Einstellungen der Datenerfassungs-Software, so dass Überschneidungen zwischen den Kanälen beseitigt ist. Verwenden Sie separate Spuren bei Bedarf (wenn zwei Fluorophore ähnliche Erregung Spektren haben). Richten Sie die Bildaufnahme Maximale Geschwindigkeit, 16-Bit, 4 oder mehr Durchschnitte und Auflösung 1024 x 1024 wählen oder besser. Zoomen Sie in das Objekt abgebildet werden.Hinweis: Dies verringert Erfassungszeit zu reduzieren Foto bleichen und auch zu verringern, Dateigröße und nachgelagerte Bearbeitung. Richten Sie den Z-Stapel. Wählen Sie den optimalen Schnitt für das Ziel verwendet wird. Später Wunsch Dekonvolution mithilfe eines Z-Schritts kleiner als optimale wie 1 µm. Verwenden Sie die Z-Stapel-Korrektur. Beginnen Sie am nächsten der Oberfläche des Gewebes und erhöhen Sie den Gewinn zu, da das Ziel durch die Z-Ebene konzentriert und fügen Sie Korrekturen hinzu. Verändern Sie nicht die Lasereinstellungen für die Korrektur! Erwerben Sie einen Test-Stack mit einem Durchschnitt, Auflösung von 512 x 512 und maximale Geschwindigkeit. Überprüfen Sie das Bild in 3D, um sicherzustellen, dass vor dem Erwerb des endgültige hochauflösende Z-Stapels gleicher Helligkeit während der Stapel für jede Farbe gibt. Lichtscheibe Imaging Sicherstellen Sie, dass die Proben haben in Felgen für imaging für mindestens 24 h im Idealfall equilibriert wurde, die Proben an frische Felgen in der bildgebenden Kammer übertragen und für mindestens einen Tag in der Kammer equilibrate erlauben. Montieren Sie die Probe für die Bildgebung Wählen Sie die kleinste (schwarze) Kapillare, Probe zu montieren Verwenden Sie Kitt oder eine Schüssel, um die Probe zu halten, während der Anwendung von Superkleber bis zum Ende der Kapillare. Kleben Sie das Gewebe in der Kapillare eine Oberfläche des Gewebes möglichst so wenig zu berühren. Legen Sie die Probe für die Bildgebung. Bild mit 5 X oder 25 X Ziele geeignet für optisch geräumte Proben mit den Drehpunkt Option scannen. Tritt shadowing oder Unschärfe, drehen die Probe und versuchen Sie es erneut, oder lassen Sie die Probe in Felgen equilibrate weiterhin.Hinweis: Ein Stapel von 1 mm kann in der Regel in weniger als fünf Minuten, abhängig von den Einstellungen erworben werden. Zeigen Sie an und bearbeiten Sie die Bild-Stacks mit der Bildanalyse-Software.