Высокое разрешение 3D визуализации нейро островной сети человека поджелудочной железы

Все эксперименты проводились в соответствии с университета штата Флорида институциональных Наблюдательный Совет и федеральных руководящих принципов. Предупреждение: Параформальдегида акриламида и токсичных раздражителей. Обработайте реагентов в Зонта с соответствующие средства индивидуальной защиты (лаборатории пальто, перчатки, средства защиты глаз). 1. депарафинизации формальдегида Исправлена тканей (при работе с свежими тканей, перейдите к шагу 2) Используйте новое лезвие бритвы или скальпель прорезать парафина перпендикулярно поверхности ткани. Вырежьте парафина на краю ткани, чтобы закончить, ослабление его. Используйте щипцы или шпателем для Осторожно ослабьте и удалите ткани оптически очищается. Аккуратно очистите избыток парафин из ткани с помощью шпателя (рис. 1A). Заполнить стеклянную тару с ксилола (около 30 мл на 3 x 3 x 3 мм в разделе ткани) и инкубировать ткани в это решение в течение 24 ч при комнатной температуре (RT). Заполните другой стеклянной тары с свежими ксилол с того же объема, как 1.2.1. Передача и инкубировать ткани в это решение в течение 24 ч в рт. Место 100% этанола в коническую пробирку с того же объема, как 1.2.1. Передача и инкубировать ткани в это решение в течение 24 ч в рт. Место 95% этанола в коническую пробирку с того же объема, как 1.2.1. Передача и инкубировать ткани в это решение в течение 24 ч в рт. Место 70% этанола в коническую пробирку с того же объема, как 1.2.1. Передача и инкубировать ткани в это решение в течение 24 ч в рт. Полоскания тканей в фосфата 0,01 М буфер солевой раствор (PBS) и место в 0,01 М PBS в коническую пробирку, чтобы сбалансировать для 24 h на RT. Убедитесь что ткани бесплатно парафина (рис. 1B, правая панель). 2. Подготовьте фиксатором параформальдегида (PFA) 4% Пипетка 10 мл 16% ПФА в 50-мл Конические трубки, добавить 4 мл 0,1 М PBS, а 26 мл дистиллированной деионизированной воды (ddH2O). Закройте крышку и перемешать кратко. Большие объемы 4% PFA может производиться вперед и замороженных в аликвоты. Аликвоты хороши для 1 дня при комнатной температуре (RT), одну неделю на 4 ° C и 1 месяца при температуре-20 ° C. 3. поджелудочная железа фиксации Исправьте пример поджелудочной железы (≤ 1 x 1 x 2 см) в свежеприготовленные 4% PFA при 4 ° C в течение 48 часов. Если образец больше чем 1 x 1 x 2 см, использовать скальпелем или лезвием бритвы для рассечения в более мелкие кусочки толщиной не более 1 см. Вымойте образца ткани в три изменения 0,01 М PBS для по крайней мере 15 минут каждый мыть и хранить в 15 мл пластиковых пробирок в 0.01% PFA/0.01 М PBS или 0,5% натрия азид/0.01 М PBS до использования. После фиксации в разделе ткани в 1-2 мм толщиной разделы для дальнейшей обработки. Используйте vibratome для оказания помощи в даже секционирование.Примечание: Окончательное количество секций будет зависеть от размера отправной образца. 4. внедрить ткани в Гидрогель 200 мл раствора гидрогеля мономера акриламида/1% параформальдегида (A4P1) 4% готовят следующим образом: Место колбу на льду в ведро с верхней плиты магнитные перемешать. Убедитесь, что плоские сидит колбу и добавить панель магнитные перемешать. Добавьте следующее в порядке: 147,8 мл холодной ddH2O (4-8 ° C), 20 мл 0,1 М PBS, холодный (4-8 ° C) 20 мл 40% акриламида раствор, 12,2 мл раствора PFA 16% и инициатор 250 мг VA-044. Mix решение всего гидрогеля с магнитной перемешать бар для по крайней мере 10 мин и оставьте раствор на льду для следующего шага. Место 15 мл конические пробки во льду рядом с флакон, содержащий решение гидрогеля. Пипетка 14 мл раствора мономера в трубку и добавить одну часть образца толщиной фиксированной ткани 1-2 мм. Затем крышку трубки. Инкубировать образцов в растворе мономер для 3 дней при температуре 4 ° C и защищать от света. Аликвота оставшиеся мономера решения и хранить при температуре-20 ° C для использования в будущем. 5. дегазировать мономера решения и полимеризоваться Гидрогель Удаления кислорода из гидрогеля мономера решения с использованием газообразных N28. Подготовить ведро льда и поместите образец в решении мономера гидрогеля на льду. Сбор 2-3, 18-калибровочного иглы для каждого образца, парафин фильм и таймер. Соединение труб с азота танк, чтобы азота может течь. При сохранении образца на льду, тщательно проколоть крышечка коническая трубка, содержащая образец на одной стороне и нажмите одну подкожную иглу пока он находится под поверхностью раствора жидкого мономера. Использовать другой подкожных игл для прокола противоположной стороне крышку, но не позволяют ему стать погружен.Примечание: Вторая игла будет вентиляционные трубы. Подключите труб из бака азота для подкожных иглы погруженным под гидрогеля и медленно включите азота до тех пор, пока он кипит неуклонно через жидкости. Разрешить азота в пузырь через жидкости для 10 мин. Как только кислород удаляется, быстро удалить обе иглы и заглушка с парафином фильм, чтобы предотвратить любой дальнейший обмен газов между трубой и окружающей среды. Поместите образец разгазированной в инкубаторе при 37 ° C 3 h для полимеризации гидрогеля. 6. ткани очистка Подготовка 500 мл, очистка раствора (4% SDS в рН 8,5). ~ 300 мл ddH2O добавьте 50 мл 0,1 М PBS и 20 g SDS порошок, помешивая магнитной перемешать бар. Настройка решения с помощью гидроксида натрия и соляной кислоты до pH 8,5. Добавьте ddH2O до тех пор, пока конечный объем составляет 500 мл. После полимеризации слейте излишки гидрогеля и выбросьте его в контейнер химических отходов. Используйте бумажную салфетку, аккуратно протрите прочь гидрогеля из образца и отменить в контейнер химических отходов. Помойте образец в 3-5 обмены 0,01 М PBS (отменить мыть жидкости в химических отходов) для 15 мин каждый шаг мыть. Передача образцов в 50 мл конические с 40 мл очистка буфера. Инкубировать образец в очистка буфера при 37 ° C и изменить образец на свежие очистка буфера каждый день. Оставьте образец в очистка буфера для 2-8 недель в зависимости от размера выборки (~ 8 недель для 3 мм × 3 мм × 3 мм образца) для обеспечения надлежащей очистки. Контролировать очистки ткани и остановки, когда полный. Убедитесь, что образец адекватно прозрачным, удерживая его до света для проверки надлежащей очистки (обычно некоторые загар окраски останется в экзокринных областях).Примечание: Пример чрезмерно очищается появится изношен на краях и текстура будет очень мягкими, когда взял с щипцами. Она является общей для образца очистить неравномерно. Кроме того ткань не будет полностью прозрачным, до тех пор, пока в монтаж СМИ (вставка, Рисунок 1 c). 7. несколько иммунофлуоресценции Вымойте образцы на шейкер на 60 об/мин на RT на один день с 40 мл 0,01 М PBS меняется свежие буфер часто (4-5 буфера изменения в всего, 40 мл каждого мытья, меняется каждый час до окончательного мыть). Пусть окончательный мыть продолжить на ночь на RT. Подготовьте Пакт, окрашивание буфера. В 500 мл 0,01 М PBS добавьте азид натрия 50 мг и 0,5 мл TritonX-100. Хорошо перемешайте. Инкубируйте образца с первичных антител. Добавить 2% нормальной сыворотки (же видов как вторичное антитело) базового Пакт, окрашивание буфера в плоское дно 2-мл пробирку (по крайней мере 1 мл общий объем рекомендуется за образец/трубки). Добавьте основное антитело в 2% сыворотки/Пакт пятнать буфера. Используйте примерно 5 x количество первичных антител для окрашивания Пакт, как будет использоваться для стандартных иммуногистохимия (т.е. Если антитела разбавленных 1: 500 для стандартных иммуногистохимии, использование масштаба 1: 100 для окрашивания пакт). Чтобы удалить образец из буфера мытья и dab излишки буфера покинуть на бумажное полотенце, а затем поместить в трубку с раствором основное антитело лопаточкой. Проинкубируйте 2-4 дня в РТ на шейкер на 60 об/мин. Тщательно вымойте образцы на RT на шейкер на 60 об/мин в 0,01 М PBS меняется свежие буфер 4 – 5 раз и оставив последний мыть на ночь как шаг 7.1. Проинкубируйте образцы с вторичные антитела. Добавить 2% нормальной сыворотки (же видов как вторичное антитело) базового Пакт, окрашивание буфера в плоское дно 2-мл пробирку (общий объем 1 мл рекомендуется за образец/трубки). Добавление вторичного антитела в концентрации 1: 200 (5 мкл в буфере 1 мл).Примечание: Малый формат антитела являются предпочтительным, а также весьма кросс адсорбированные антител при использовании более чем одного основного антитела. Чтобы удалить образец из буфера мытья и dab излишки буфера покинуть на бумажное полотенце, а затем поместить в трубку с раствором вторичное антитело лопаточкой. Инкубируйте на RT на шейкер на 60 об/мин в течение 2 дней и защиты образца от света. Тщательно промойте образцы, как шаг 7.1, в РТ на шейкер на 60 об/мин в 0,01 М PBS меняется на свежие буфер 4 – 5 раз и оставляя окончательный мыть на ночь, защищать от света во время мойки. 8. Монтаж образцы для изображений Подготовьте преломления буфер соответствующего решения (колеса). Весят из 11 g неионных плотность градиента среды (например, Histodenz) и тщательно передачи в 50-мл Конические трубки. Добавьте ~ 5 мл 0,02 М фосфатного буфера (PB)8 с помощью шпателя для выпуска воздуха из среднего градиента неионных плотность порошка.Примечание: Решение будет очень вязкой, хорошо перемешать. Довести объем до 10 мл, с использованием более PB, смешать с помощью шпателя и скрести избыток от шпателя в трубу. Инкубировать колеса при 37 ° C, до растворения, инвертировать и осторожно перемешать при необходимости. Передача образцов в колеса. Чтобы сделать это, Пипетка колеса 1 мл в 2-мл пробирку с плоским дном. Чтобы удалить образец из буфера мытья и dab излишки буфера покинуть на бумажное полотенце, а затем поместить в трубку с колеса решения лопаточкой. Аккуратно нажмите трубки погружаться в образце в колеса. Поместите образцы в колеса на скамейке, защищенном от света на RT для 2-4 дня до изображений. Для изображений, место небольшое количество колеса в coverslip 8-Ну нижней палаты слайд. Только добавить просто достаточно, чтобы покрыть дно, больше вызовет образца до плавать, затрудняя изображения на Перевернутый сферы. Добавить образец в колодец и крышка слайд для воображения. 9. изображений Конфокальная микроскопия и обработки изображений Выберите соответствующие лазеры для возбуждения и выбросов спектры флуорофоров, используется для пятно образцы Пакт. Настройте параметры приобретения программного обеспечения, таким образом, чтобы устранить любое дублирование между каналами. Использование отдельных треков при необходимости (когда два флуорофоров имеют аналогичные спектры возбуждения). Настройка загрузки изображений Выберите скорость максимальная приобретения, 16 бит, 4 или более средние и разрешение 1024 x 1024 или лучше. Увеличить в объект для записи образа.Примечание: Это позволит уменьшить время аэросъёмки для уменьшения обесцвечивания фото и также уменьшить размер файла и ниже по течению редактирования. Установка z стека. Выберите оптимальный секционирование для достижения цели используются. Если позднее Деконволюция, используйте z шаг меньше оптимального например 1 мкм. Использование z стека коррекции. Начало ближайшего поверхности ткани и увеличить прибыль, как цель фокусируется через z плоскость и добавлять исправления. Не изменяйте параметры лазера для коррекции! Приобрести проверка стека с одной средней, 512 x 512 резолюции и максимальной скоростью. Проверьте изображение в 3D, чтобы убедиться, что есть равные яркость во всем стеке для каждого цвета до получения окончательного разрешением z стека. Lightsheet изображений Убедитесь, что образцы достижение равновесного для визуализации для по крайней мере за 24 ч. в идеале были уровня в колеса, передавать образцы свежие колеса в тепловизионной камере и позволяют сбалансировать в камере для по крайней мере в день. Смонтировать образца для изображений Выберите наименьший (черный) капилляра для монтирования образца Использование замазки или блюдо провести образца при применении супер клей в конец капилляра. Приклейте ткань для капиллярной, касаясь как мало поверхности ткани как можно. Вставка образца для изображений. Изображение с помощью 5 X или 25 X целей подходит для оптически свободные образцы с использованием pivot сканирования вариант. Если затенение или размытия происходит, вращать образец и попробуйте еще раз или пусть образец продолжать сбалансировать в колеса.Примечание: 1 мм стек обычно могут быть приобретены в менее чем пяти минут, в зависимости от настройки. Просмотр и редактирование стеки изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображения.