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Bioengineering

Proyección de imagen 3D de alta resolución de la red Neuro-insular del páncreas humano

Published: January 29, 2018
doi:
10.3791/56859
, , , , , , , ,
1Department of Pathology, Immunology and Experimental Medicine,University of Florida, 2Heller School for Social Policy and Management,Brandeis University, 3Department of Medicine, College of Medicine,University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering,University of Florida, 5Department of Pediatrics, College of Medicine,University of Florida

Summary

Aquí, presentamos un pasivo de las secciones de páncreas humano de imagen en tres dimensiones (3D) mediante protocolo optimizado métodos de compensación. Este manuscrito muestra estos procedimientos para pasivo óptico claro seguido por múltiples inmunofluorescencia que manchaba para identificar los elementos claves de las redes neuronales autonómicas y sensoriales inervan islotes humanos.

Abstract

Métodos histológicos tradicionales, los investigadores se ven obstaculizados en su capacidad de imagen todo tejidos u órganos en 3D a gran escala. Las secciones histológicas se limitan generalmente a < 20 μm como formalina fijada parafina sección sobre portaobjetos de vidrio o 500 μm utilizando métodos tradicionales. Además, luz dispersiones de macromoléculas dentro de los tejidos, especialmente lípidos, evita la proyección de imagen a una profundidad de > 150 μm con microscopios confocales más. Para reducir la dispersión de la luz y permitir tisular profunda usando microscopia confocal simple, varios métodos de compensación óptica se han desarrollado que son relevantes para las muestras de tejido de roedores y humanos fijos por inmersión. Varios métodos están relacionados con y utilizan proteína reticulación con acrilamida y tejido claro con dodecil sulfato de sodio (SDS). Otras técnicas de compensación óptica utilizan varios solventes aunque cada modificación tenía varias ventajas y desventajas. Aquí, se describe un método de compensación óptica pasiva optimizada para los estudios de la inervación del páncreas humano y específicamente para el interrogatorio de la inervación de los islotes humanos.

Introduction

Hasta hace poco, 3 dimensiones (3D) reconstrucción de grandes tejidos u órganos enteros se realizó mediante seccionamiento serial laborioso, coloración y reconstrucción de imágenes de secciones múltiples. Estos métodos tenían varias desventajas, incluyendo confianza en un gran número de secciones seriadas, penetración deficiente del tejido con anticuerpos y la luz dispersión evitando la proyección de imagen profunda dentro de los tejidos. Para permitir una mayor luz y penetración de anticuerpos, los investigadores desarrollaron métodos químicos para conservar los antígenos de la proteína mientras que quita la mayoría de los lípidos de la dispersión de luz. Varios relacionados con los métodos son hidrogel de acrilamida Clear Lipid-Exchanged-cruzado por hibridación rígido tejido de proyección de imagen (claridad), pasivo claridad técnica (Pacto) y liberación de agente de perfusión asistida in situ (PARS) (revisado en 1,2 ,3,4,5,6). El método de claridad se basa en la estabilización de proteínas usando un formaldehído, acrilamida y bis hidrogel seguido por extracción de lípidos mediante electroforesis en SDS solución2. Este enfoque fue posteriormente había modificado para pasivo claro y avanzado imagen7. Otra optimización condujo a la eliminación del bis y porcentajes variables de paraformaldehido en la solución de hidrogel (1-4%) para obtener la estabilización óptima del antígeno con el menor tiempo de compensación para una técnica llamada Pacto 8. Primeros intentos para desarrollar estas técnicas de compensación óptica involucrada orgánicos u otros compuestos que eran difíciles de trabajar y proteínas fluorescentes endógenas apagadas en modelos de ratón transgénico. Estos métodos adicionales incluyeron escalas, análisis computacional y cócteles de cerebro/cuerpo sin obstrucciones (cúbico), interruptor y Dimensional Imaging of Solvent-Cleared órganos (DISCO), todos con diferentes ventajas y desventajas9, 10,11,12. El método original de claridad fue desarrollado en el tejido cerebral de ratón rico en lípidos y métodos de compensación óptica limitadas pruebas en tejidos humanos7,8,11,13,14 .

Métodos de compensación óptica son ideales para nervios de rastreo a larga distancia como en el ratón intacta del sistema nervioso central. El páncreas también es inervado por el sistema nervioso sensorial y autonómica. El compartimiento endocrino pancreático, islotes de Langerhans, conforman una muy pequeña porción del órgano entero (1-2%) e islotes han sabido heterogeneidad en los tamaños (50-250 μm), las proporciones de células endocrinas y densidad particular en la diabetes (revisado en 15 ,16). En el desarrollo de un protocolo, probaron a varios métodos de compensación óptica para páncreas humano y un procedimiento de Pacto fue encontrado para proporcionar el mejor equilibrio entre tiempo de claro (~ 2 semanas) con excelente preservación morfológica de nervios y de islotes. Aquí se describe el procedimiento optimizado final en el trazado de la red neuro-insular a gran escala (distancias de milímetros) y alta resolución imágenes en 3D de múltiples islotes pancreáticos intactos. La técnica es conveniente para el páncreas humano inmediatamente después de la fijación o después de almacenamiento, así como las muestras fijadas en formalina tamponada neutra y embebidos en parafina. Las muestras son adecuadas para la proyección de imagen de confocal o la microscopia lightsheet.

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo según la Junta de revisión institucional de la Universidad de Florida y federales. PRECAUCIÓN: Paraformaldehido y acrilamida son irritantes tóxicos. Manejar los reactivos en una campana de humos con equipo de protección personal (bata, guantes, protección ocular). 1. parafina de tejidos fijados en formol (si trabaja con tejidos frescos, vaya al paso 2) Utilizar una nueva hoja de afeitar o bisturí para cortar a través la parafina perpendicular a la superficie del tejido. Cortar la parafina en el borde del tejido para terminar lo aflojando. Utilizar pinzas o una espátula para aflojar suavemente y extirpar el tejido que ópticamente se despejó. Raspar suavemente la parafina sobrante de los tejidos con una espátula (figura 1A). Llenar un recipiente de vidrio con xileno (aproximadamente 30 mL de 3 x 3 x 3 mm de sección de tejido) e incubar el tejido en esta solución durante 24 h a temperatura ambiente (RT). Llenar otro recipiente de vidrio con xileno fresca con el mismo volumen que la 1.2.1. Transferencia e incubar el tejido en esta solución durante 24 h a TA. Coloque el 100% de etanol en un tubo cónico con el mismo volumen que la 1.2.1. Transferencia e incubar el tejido en esta solución durante 24 h a TA. Coloque etanol al 95% en un tubo cónico con el mismo volumen que la 1.2.1. Transferencia e incubar el tejido en esta solución durante 24 h a TA. Coloque el etanol al 70% en un tubo cónico con el mismo volumen que la 1.2.1. Transferencia e incubar el tejido en esta solución durante 24 h a TA. Enjuague el tejido en 0.01 M fosfato tampón salino (PBS) y el lugar en PBS de 0.01 M en un tubo cónico a equilibrar durante 24 h a RT. Asegúrese que el tejido esté libre de parafina (figura 1B, panel derecho). 2. prepare 4% paraformaldehido (PFA) fijador Pipetear 10 mL 16% PFA en un tubo cónico de 50 mL, añadir 4 mL 0.1 M PBS y añadir 26 mL agua destilada desionizada (ddH2O). Cierre la tapa y mezcle brevemente. Volúmenes mayores de 4% PFA puede hacerse por delante y congelado en alícuotas. Alícuotas son buenas por 1 día a temperatura ambiente (RT), una semana a 4 ° C y 1 mes a-20 ° C. 3. páncreas fijación Fijar la muestra de páncreas (≤ 1 x 1 x 2 cm) en 4% recién preparado PFA a 4 ° C durante 48 h. Si la muestra es mayor de 1 x 1 x 2 cm, utilizar un bisturí o navaja para diseccionar en pequeñas piezas de no más de 1 cm de espesor. Lavar la muestra de tejido en tres cambios de PBS de 0.01 M durante al menos 15 min cada colada y almacenar en tubo de centrífuga de 15 mL en 0.01% PFA/0.01 M PBS o 0.5% sodio azida/0.01 M PBS hasta su uso. Después de la fijación, secciona el tejido en secciones gruesas de 1-2 mm para su posterior procesamiento. Utilice un vibratome para ayudar a incluso de seccionamiento.Nota: El número final de secciones dependerá del tamaño de la muestra inicial. 4. Insertar tejido en hidrogel Preparar 200 mL de solución 4% de monómero de acrilamida/1% paraformaldehido (A4P1) hidrogel como sigue: Coloque un matraz en el hielo en un cubo en la parte superior de una placa de agitación magnética. Asegúrese de que el frasco está sentado plana y añadir una barra de agitación magnética. Agregue lo siguiente en orden: 147,8 mL ddH2O frío de (4-8 ° C), 20 mL 0.1 M PBS, solución 20 mL fría (4-8 ° C) de 40% acrilamida, 12,2 mL 16% PFA solución e iniciador 250 mg VA-044. Mezcle la solución entera de hidrogel con una barra de agitación magnética durante al menos 10 minutos y dejar la solución en el hielo para el siguiente paso. Coloque un tubo cónico de 15 mL en el hielo junto al matraz que contiene la solución de hidrogel. Pipetear 14 mL de solución de monómero en el tubo y añadir una pieza el 1-2 mm espesor fijo de muestra de tejido. Luego cerrar el tubo. Incubar la muestra en solución de monómero durante 3 días a 4 ° C y proteger de la luz. Alícuota cualquier resto de solución de monómero y almacenar a-20 ° C para su uso futuro. 5. desgasificar la solución de monómero y polimerizar el hidrogel Quitar el oxígeno de la solución de monómero de hidrogel con gaseosa N28. Preparar un cubo de hielo y colocar la muestra en la solución de monómero de hidrogel en el hielo. Se reúnen 2-3 agujas de hipodérmicas de calibre 18 por ejemplo, película de parafina y un temporizador. Conecte la manguera al tanque de nitrógeno para que el nitrógeno pueda fluir. Manteniendo la muestra en hielo, cuidadosamente perforar la tapa de un tubo cónico que contiene la muestra en un lado y presiona una aguja hipodérmica a través hasta que está debajo de la superficie de la solución de monómero líquido. Usar otra aguja hipodérmica para perforar el lado opuesto de la tapa, pero no permita que se sumerja.Nota: La segunda aguja ventilará el tubo. Conectar la tubería desde el tanque de nitrógeno a la aguja hipodérmica sumergida bajo el hidrogel y gire lentamente en el nitrógeno hasta que está burbujeando constantemente a través del líquido. Permita que el nitrógeno de la burbuja a través del líquido durante 10 minutos. Una vez retirado el oxígeno, rápidamente retirar ambas agujas y cubrir la tapa con una película de parafina para prevenir cualquier otro intercambio de gases entre el tubo y el medio ambiente. Coloque la muestra desgasificada en una incubadora a 37 ° C durante 3 h polimerizar el hidrogel. 6. tejido claro Preparar 500 mL de solución (4% SDS a pH 8.5) del claro. A ~ 300 mL de ddH2O, añadir 50 mL 0.1 M PBS 20 g SDS polvo y removiendo con una barra de agitación magnética. Ajustar la solución con hidróxido de sodio y ácido clorhídrico a pH 8.5. Añadir ddH2O hasta que el volumen final es de 500 mL. Después de la polimerización, vierta lejos exceso hidrogel y descartarlo en un contenedor de residuos químico. Use una toalla de papel suavemente Limpie lejos hidrogel de la muestra y desechar en un contenedor de residuos químico. Lavar la muestra en 3-5 intercambios de 0.01 M PBS (descartar líquido de lavado en los residuos químicos) durante 15 min cada paso de lavado. Transferir la muestra en un tubo cónico de 50 mL con 40 mL de tampón del claro. Incubar la muestra en el búfer de claro a 37 ° C y cambiar muestra a almacenador intermediario fresco claro cada día. Dejar la muestra en el búfer de claro para 2 a 8 semanas dependiendo del tamaño de la muestra (~ 8 semanas para un 3 x 3 mm x 3 mm muestra) para asegurar la limpieza adecuada. Supervisar limpieza de tejidos y detener cuando termine. Asegurar que la muestra es suficientemente transparente sosteniendo a la luz para verificar la correcta claro (generalmente algún colorante tan permanecerá en las regiones exocrinas).Nota: Una muestra demasiado despejada aparecerá deshilachada en los bordes y la textura será muy suave cuando recogió con pinzas. Es común que la muestra a clara irregularmente. Además, el tejido no será totalmente transparente hasta que colocado en un soporte multimedia (insertar, figura 1). 7. múltiples inmunofluorescencia Lavar las muestras en un agitador a 60 rpm a temperatura ambiente por un día con 40 mL 0,01 M PBS cambiando a menudo fresco búfer (buffer de 4 y 5 cambios en total, 40 mL cada colada, cambiando cada h hasta el lavado final). Deja que el último lavado continúe durante la noche a TA. Preparar el Pacto de tampón de tinción. Añadir a 500 mL 0,01 M PBS, azida de sodio 50 mg y 0.5 mL TritonX-100. Mezclar bien. Incubar la muestra con anticuerpos primarios. Agregar 2% de suero normal (misma especie que el anticuerpo secundario) al Pacto base de tampón en un tubo de fondo plano de 2 mL de tinción (se recomienda al menos 1 mL de volumen total por tubo de la muestra). Añadir el anticuerpo primario al 2% suero/Pacto de tampón de tinción. Utilice aproximadamente 5 veces la cantidad de anticuerpo primario para la tinción de Pacto ya que se utilizaría para inmunohistoquímica estándar (es decir, si un anticuerpo es diluido 1: 500 para inmunohistoquímica estándar, uso 1: 100 para la tinción de Pacto). Espátula, retire la muestra de la solución de lavado y absorba el exceso de tampón fuera sobre una toalla de papel, luego coloque en el tubo con una solución de anticuerpo primario. Incubar 2-4 días a temperatura ambiente en un agitador a 60 rpm. Lavar bien las muestras a temperatura ambiente en un agitador a 60 rpm en PBS de 0.01 M cambio a almacenador intermediario fresco 4 – 5 veces y dejando el lavado final de la noche a la mañana como en el paso 7.1. Incubar las muestras con anticuerpos secundarios. Agregar 2% de suero normal (misma especie que el anticuerpo secundario) al Pacto base de tampón en un tubo de fondo plano de 2 mL de tinción (se recomienda 1 mL de volumen total por tubo de la muestra). Añadir anticuerpos secundarios a una concentración de 1: 200 (5 μL en 1 mL de tampón).Nota: Pequeño formato los anticuerpos son anticuerpos preferidos, así como altamente adsorbido a Cruz si utiliza más de un anticuerpo primario. Espátula, retire la muestra de solución tampón de lavado y absorba el exceso de tampón fuera sobre una toalla de papel, luego coloque en el tubo con una solución de anticuerpo secundario. Incubar a temperatura ambiente en un agitador a 60 rpm durante 2 días y proteja la muestra contra la luz. Lave bien las muestras, como en el paso 7.1, a temperatura ambiente en un agitador a 60 rpm en PBS de 0.01 M cambio al buffer fresco 4 – 5 veces y dejando la final lavar de noche, proteger de la luz durante el lavado. 8. montaje de las muestras para la proyección de imagen Preparar el buffer de solución emparejado (llantas) de índice de refracción. Pesar 11 g de medio de gradiente de densidad no iónico (por ejemplo, Histodenz) y con cuidado se transfiere a un tubo cónico de 50 mL. Añadir ~ 5 mL 0.02 M fosfato buffer (PB)8 usando una espátula para liberar el aire del medio gradiente de densidad no-iónico de polvo.Nota: La solución será muy viscoso, mezcla bien. Llevar el volumen a 10 mL con PB más y mezclar con una espátula raspe el exceso de la espátula en el tubo. LLANTAS de incubar a 37 ° C hasta que se disuelva, invertir y mezclar suavemente como sea necesario. Transferencia de las muestras en los bordes. Para ello, Pipetear 1 mL llantas en un tubo de 2 mL con fondo plano. Espátula, retire la muestra de solución tampón de lavado y absorba el exceso de tampón fuera sobre una toalla de papel, luego coloque en el tubo con solución de llantas. Golpee suavemente el tubo para sumergir la muestra en los bordes. Coloque las muestras en llantas en el banquillo protegido de la luz a temperatura ambiente durante 2-4 días antes de la proyección de imagen. Para la imagen, coloque una pequeña cantidad de llantas en una diapositiva de cámara inferior 8-bien cubreobjetos. Sólo añadir lo suficiente para cubrir la parte inferior, más hará la muestra a flotar haciendo más difícil a la imagen en un ámbito invertido. Agregar la muestra al pozo y la tapa de la diapositiva para la proyección de imagen. 9. proyección de imagen de Microscopía confocal y software de imágenes Seleccione el láser adecuado para la excitación y espectros de emisión de los fluoróforos utilizado para teñir las muestras de Pacto. Ajustar los parámetros de software de adquisición de la que se elimina cualquier superposición entre los canales. Use pistas separadas, si es necesario (cuando dos fluoróforos tienen espectros de excitación similares). Establecer la adquisición de la imagen Elegir la velocidad máxima, 16 bit, medias de 4 o más y resolución de 1024 x 1024 o mejor. Zoom en el objeto a ser reflejado.Nota: Esto reducirá el tiempo de la adquisición para reducir foto-blanqueo y también disminuir el tamaño de archivo y edición aguas abajo. Configuración de la pila de z. Seleccione la sección óptima para el objetivo de ser utilizado. Si posteriormente se desea deconvolución, utilice un paso z menor que óptima como 1 μm. Utilice la corrección z-stack. Comenzar más cercano a la superficie de los tejidos y aumentar la ganancia a medida que el objetivo se enfoca a través del plano z y añadir correcciones. ¡No cambie la configuración de láser para la corrección! Adquirir una pila de prueba con una media, resolución de 512 x 512 y la velocidad máxima. Verifique la imagen en 3D para asegurarse de que hay igual brillo a lo largo de la pila para cada color antes de adquirir el z-pila alta resolución final. Proyección de imagen de Lightsheet Asegurar que las muestras han sido equilibradas en llantas para la proyección de imagen de al menos 24 h. idealmente, transferir las muestras a llantas frescas en la sala de proyección de imagen y permiten equilibrar en la cámara de al menos un día. Montaje de la muestra para la proyección de imagen Seleccione el capilar más pequeño (negro) para montar la muestra Utilice masilla de minio o un plato para sostener la muestra mientras se aplica pegamento en el extremo del tubo capilar. Pegar el tejido capilar tocar como poco una superficie del tejido como sea posible. Inserte la muestra para la proyección de imagen. Imagen 5 X o 25 X objetivos adecuados para la opción de analizar las muestras ópticamente limpia con el perno. Si remedo o desenfoque, rotar la muestra y vuelva a intentarlo o deja que la muestra continúe se equilibren en los bordes.Nota: Una pila de 1 mm puede ser adquirida generalmente en menos de cinco minutos, dependiendo de la configuración. Ver y editar las pilas de imágenes utilizando el software de análisis de imagen.

Representative Results

Estos procedimientos de tinción fueron desarrollados para proporcionar un examen a gran escala del páncreas humano examinar islotes y redes autonómicas y sensoriales asociadas. Se probaron varios procedimientos incluyendo claridad7, iDISCO17, y Pacto8 con el método del Pacto encontrado mejor adaptado para el páncreas humano y proyección de imagen confocal. Anticuerpos primarios fueron probados inicialmente en fija muestras de páncreas humano con muestras de control positivo y negativo adecuado (ratón cerebro, otros). Los anticuerpos primarios y diluciones sugeridas se enumeran en la Tabla de materiales, aunque cada laboratorio puede pretender optimizar las diluciones de anticuerpo dependiendo de la fuente de tejido y número de lote. Variación de lote a lote del anticuerpo primario puede afectar la intensidad de la tinción y la especificidad y requieren validación para lograr el mismo grado de intensidad de la mancha como con los reactivos anteriores. En el páncreas humano, islotes fueron delineados por la insulina, glucagón y secretogranin 3 (figura 2). Las células de Schwann se delinearon con la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP, figura 2 y Figura 3A). Los nervios teñidos con anticuerpos contra el marcador parasimpático el péptido intestinal vasoactivo (VIP) se reflejada en el Lightsheet (figura 3B). Los nervios simpáticos pueden verse con la coloración para tirosina hidroxilasa (no mostrado). Figura 1. Compensación óptica de páncreas humano. (A) una hoja de afeitar se utiliza para cortar y soltar una sección de tejido parafina-encajado (paneles superiores) antes de retirar la sección del tejido y raspar lejos exceso parafina del tejido (paneles inferiores). Las muestras de tejido representativo aparecen antes (B, C parte superior izquierda) y después (B derecha, C media) óptico claro del tejido parafina-encajado, tal como se describe en la sección de protocolo. Los hayan borrado, fijado el tejido no es completamente transparente después de borrar (B derecha, parte superior de la C) y a menudo tejido hinchazón puede ser apreciado (C, panel central). El tejido despejado se vuelve totalmente transparente después de equilibrar en los bordes (C, panel inferior). Barras de escala: 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Red neuro-insular humana. Muestras de páncreas humano eran despejaron descrito de NPDO donantes de órganos o de tejidos parafina-encajadas archivales. (Ad) Células de Schwann (GFAP +, blanco) y las células endocrinas se muestran manchas por la insulina (rojo) y glucagón (verde). Confocal (A) la microscopia y la máxima proyección de intensidad (MIP) muestra seguimiento de células de Schwann (GFAP +) nervios cursando junto a los vasos sanguíneos en la periferia del islote y extendiendo en los islotes. El recuadro muestra alta resolución obtiene y muestra el contacto entre las células de Schwann GFAP + y células endocrinas. (B) una imagen 3D del panel (escala: x = 50 μm, y = 20 μm, z = 25 μm) A. Una muestra de parafina-Pacto aparece reflejada a través de microscopía confocal y la presentamos como una proyección de intensidad máxima (C) y en 3D (D), escala: x, y = 50 μm, z = 25 μm). Barras de escala , C: 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. visualización en 3D y la costura. Se adquirieron tres pilas de cosido de la imagen de células de Schwann manchadas con GFAP y microscopía confocal y rastrearla con un plugin de tracer neurite en el software de análisis de imagen. (A) se muestra el relleno 3D de la traza (barras de escala: x = 150 μm, y = 200 μm (0,2 mm), z = 120 μm) (B) un pacto muestra fue manchado con anticuerpo VIP y fotografiada con un microscopio de lightsheet. La pila es > 1 mm en profundidad y las fibras nerviosas se ven claramente en alta resolución. Se observan fibras envolviendo un conducto (D, primer plano) y un ganglio (G, fondo) (cuadrícula grande: x, y, z = 200 μm; marca marcas: x, y, z = 40 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La disponibilidad de nuevos métodos de compensación óptica ha permitido exámenes a gran escala sin precedentes de la central y los sistemas nerviosos periféricos en modelos animales. Los patrones de inervación general del páncreas humano son en gran parte inexplorados debido a la densidad del tejido y las dificultades en la adquisición de alta calidad biológicas. Este protocolo ofrece un optimizado tejido claro protocolo para tejido de páncreas humano de muestras de archivo fijos o parafina-encajado.

Tiempo depende del tamaño de la muestra, tipo de fijador, duración, duración de almacenamiento y puede requerir 1 a 8 semanas, por lo que las siguientes consideraciones son fundamentales. Es mejor limpiar los tejidos poco después de la fijación de PFA 4% si es posible porque el almacenamiento a largo plazo aumenta el tiempo de compensación. Para minimizar el tiempo de compensación, la cantidad de PFA en el monomer de hidrogel se redujo del 4% como se usa en el paso de fijación a 1% para el páncreas humano. Para otros tejidos, especialmente los tejidos de ratón, la cantidad de PFA necesario proporcionar suficiente rigidez de hidrogel para preservar antígenos debe determinarse empíricamente. Compensación adecuada es también esencial ya que se reduce la penetración del anticuerpo en tejidos mal despejados y se incrementa la superficie de tinción de anticuerpos secundarios. Cambiar la solución claro cada otro día (o incluso diario) es mejor mantener el pH constante y detergente fresco. Por el contrario, demasiado negativamente afecta la morfología celular y aumenta la friabilidad del tejido. Ya que algunas muestras de páncreas claro irregularmente debido a patologías inherentes como las regiones de fibrosis de la pancreatitis crónica u otras patologías, es importante vigilar con frecuencia este proceso. Uso de secciones gruesas vibratome también puede ser utilizado para hacer uniformes gruesos pero no son necesario. Supervisar el proceso de compensación, por lo que las muestras se extraen detergente tan pronto como la luz pasa fácilmente a través de la muestra, asegura que la muestra es suficientemente aclarada.

Penetración del anticuerpo y la coloración superficial son cuestiones importantes a tener en cuenta con muestras de Pacto. Para asegurar la penetración de anticuerpos bien, es fundamental para incubar las muestras con los anticuerpos primarios durante al menos 2 días. Varios anticuerpos tienen tasas de difusión diferente y deben optimizarse individualmente, pero para la mayoría de los anticuerpos, 4 días fue un período suficiente para la penetración completa en una muestra de 1 mm3 . Si la coloración superficial es un problema, especialmente para la proyección de imagen Lightsheet, la muestra se puede cortar por la mitad, o la superficie disecados lejos después de la tinción. Anticuerpos de pequeño formato, cuando sea posible se espera asistir con tejido penetración8. Preconjugated anticuerpos no parecen funcionar tan bien como el mismo clon no conjugado y mayor fondo de atascamiento no específico y pobre penetración del tejido puede ser observado si funcionan en todos. Para el mejor éxito con anticuerpos preconjugated, aumentar suero y concentraciones TritonX-100 en la tinción del almacenador intermediario y usan incubaciones más (> 4 días). Después de la tinción, la incubación de la muestra en llantas para varios días es fundamental. Inflamación de tejidos autorizado en incubación PBS y llantas hace reducir a tamaño original. Especialmente con la proyección de imagen lightsheet, la muestra debe equilibrarse completamente antes de la proyección de imagen.

Cuando las muestras en el microscopio confocal de imágenes, la corrección debe establecerse cada vez que se elige una nueva posición. Diferentes profundidades de adquisición y variación en la tinción de intensidad a lo largo del tejido requiere ajustes para cada área del tejido a ser reflejada de manera óptima. Además, los anticuerpos secundarios utilizados deben ser cuidadosamente considerados. Unmixing espectral es un reto en muestras del Pacto, así que los fluoróforos se deben elegir adecuadamente una baja superposición de excitación o emisión garantizar una señal luminosa al filtrado de emisiones en el microscopio confocal. Para cada aplicación, una debe equilibrio entre resolución, velocidad de imagen y reducción de ruido para que la mejor calidad de imagen puede ser adquirido sin blanquear foto. Resolución superior a 1024 x 1024 no es detectable por el ojo humano pero puede ser necesario para algunas aplicaciones si es necesario la cuantificación de una mancha.

Hay muchas cosas que considerar al elegir una técnica de compensación óptica y la hora de elegir la óptica claro sobre otros métodos más tradicionales. Antígenos de baja abundancia no pueden ser perceptibles mediante el método de Pacto así hay limitaciones en la detección de antígeno. Ciertos antígenos como antígenos inmunológicos (CD3, CD4, CD8, etc.) son destruidos por el método del Pacto y no son detectables a pesar de anticuerpos de alta calidad disponibles para su detección. Otra limitación de este método es la variabilidad inherente entre páncreas de donantes que son difíciles de discernir hasta que después de borrar la coloración. Cada tejido de donantes tiende a claro y la mancha de manera similar entre los procedimientos, pero los tejidos donantes diferentes tienen diferentes claro y calidad de morfología de tejido después de la tala. La habilidad de usar tejido archival puede mitigar esta limitación si se puede tener acceso adecuado a un gran número de muestras de páncreas paciente aunque esto no ha sido completamente investigado. El protocolo del Pacto divulgado adjunto fue encontrado para ser barato y fácilmente implementados con equipo normal de laboratorio. Despejadas las muestras eran adecuadas para la proyección de imagen por microscopía confocal tradicional, así como 2-fotón y Lightsheet tecnologías y proporcionan alta resolución de imágenes en 3D de nervios y de islotes en grandes secciones del páncreas humano. Futuras aplicaciones de este procedimiento incluyen estudios sobre el desarrollo del páncreas fetal para compartimentos tanto exocrinas como endocrinas, islote estudios en tipo 1 y diabetes tipo 2.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Dr. Ann Fu y Joseph Canzano para asistencia técnica, Dr. Jennifer Treweek para consejos inestimables y Dr. Kristin Overton y Dr. Karl Deisseroth para entrenamiento a MCT a través del taller de la claridad de la Universidad de Stanford. JDRF NPDO y las organizaciones de adquisiciones del órgano proporcionan muestras de tejido. Este trabajo fue financiado por la JDRF (47-2014-1), Helmsley Charitable Trust (HCT 2015-PG-T1D052) y TR001773 de 1OT2 NIDDK al MCT.

Materials

10x phosphate buffered saline (PBS) Fisher BP399-1 Buffers
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher S375-500 PB buffer (RIMS)
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma 71507-250 PB buffer (RIMS)
16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15714-5 Immersion fixation, hydrogel, storage solution
40% acrylamide Bio-Rad 161-0140 Hydrogel
2% bis-acrylamide Bio-Rad 161-0142 Hydrogel
VA-044 initiator Wako Pure Chemical Industries, Ltd. VA044 Hydrogel
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-5 Clearing buffer
Sodium azide Sigma S8032 Sample storage buffer
18 gauge needles Fisher 14-840-91 Degassing hydrogel solution
N2 tank AirGas various Degassing hydrogel solution
Triton X-100 Sigma-Aldrich 100 ml Buffers
Goat, normal serum Vector S-1000 Use as 2% in blocking buffer
Histodenz Sigma D2158-100G RIMS
8-well chamber slides Ibidi 80827 Imaging
Laser scanning confocal microscope Zeiss 710 Imaging
LightSheet microscope Zeiss Z1 Imaging
Name Company Catalog Number Comments
Primary Antibody
CD45 Bioss bs-4820R-A488 Host: Rabbit
Dilution: 1:100
Comments: Did not work
CD45 DAKO M0754 Host: Mouse
Dilution: 1:200
Comments: Did not work
GFAP DAKO Z0334 Host: Rabbit
Dilution: 1:50
Comments: Worked
Glucagon BD Biosciences 565891 Host: Mouse
Dilution: 1:50
Comments: Worked
Glucagon Cell Signaling 2760S Host: Rabbit
Dilution: 1:200
Comments: Did not work
Glucagon Abcam ab10988 Host: Mouse
Dilution: 1:200
Comments: Worked
Insulin DAKO A0564 Host: Guinea Pig
Dilution: 1:200
Comments: Worked
NCAM (CD56) DAKO M730429-2 Host: Mouse
Dilution: 1:50
Comments: Did not work
NCAM (CD56)-FITC conjugate DAKO M730429-2 Host: Mouse
Dilution: 1:50
Comments: Did not work
Peripherin EnCor RPCA-Peri Host: Rabbit
Dilution: 1:100
Comments: Worked
PGP9.5 DAKO Z5116 Host: Rabbit
Dilution: 1:50
Comments: Did not work
Secretogranin 3 Sigma HPA006880 Host: Rabbit
Dilution: 1:200
Comments: Worked
Smooth muscle actin Sigma A5228; C6198 (Cy5) Host: Mouse
Dilution: 1:200; 1:200
Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated
Substance P BioRad 8450-0505 Host: Rat
Dilution: 1:200
Comments: Worked
Tyrosine Hydroxylase Millipore AB152 Host: Rabbit
Dilution: 1:200
Comments: Worked
Tyrosine Hydroxylase Abcam Ab76442 Host: Chicken
Dilution: 1:100
Comments: Worked, but weak staining
Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) Immunostar 20077 Host: Rabbit
Dilution: 1:100
Comments: Worked
Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) Synaptic Systems 139103 Host: Rabbit
Dilution: 1:50
Comments: Worked
Secondary Antibody
Guinea pig IgG ThermoFisher Scientific Various Host: Goat
Dilution: 1:200
Comments: AlexaFluor conjugates
Mouse IgG ThermoFisher Scientific Various Host: Goat
Dilution: 1:200
Comments: AlexaFluor conjugates
Rabbit IgG ThermoFisher Scientific Various Host: Goat
Dilution: 1:200
Comments: AlexaFluor conjugates
Rat IgG ThermoFisher Scientific Various Host: Goat, Donkey
Dilution: 1:200
Comments: AlexaFluor conjugates
Chicken IgG ThermoFisher Scientific Various Host: Goat
Dilution: 1:200
Comments: AlexaFluor conjugates
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References

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Butterworth, E., Dickerson, W., Vijay, V., Weitzel, K., Cooper, J., Atkinson, E. W., Coleman, J. E., Otto, K. J., Campbell-Thompson, M. High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network. J. Vis. Exp. (131), e56859, doi:10.3791/56859 (2018).
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