הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של הרשת נוירו-סקסיסטית לבלב אנושי

כל הניסויים נערכו בהתאם הועד המוסדי אוניברסיטת פלורידה והנחיות הפדרלי. התראה: Paraformaldehyde אקרילאמיד הינם רעילים המגרים. להתמודד עם ריאגנטים בשכונה fume עם ציוד מגן אישי המתאים (חלוק, כפפות, הגנה העין). 1. deparaffinization של רקמות פורמלדהיד-קבוע (אם עובדים עם רקמות טריים, דלג לשלב 2) השתמש גילוח חדש או אזמל שנחתוך את הפרפין בניצב למשטח של הרקמה. חותכים הפרפין בקצה של הרקמה לסיים ויסירו את זה. להשתמש מלקחיים או מרית לשחרר בעדינות ולהסיר את הרקמה שינוקו שטיחות. לגרד בעדינות פרפין עודף מרקמות בעזרת מרית (איור 1 א’). למלא את מיכל הזכוכית עם קסילן (בערך 30 מ”ל עבור 3 x 3 x 3 מ מ סעיף של רקמות), דגירה הרקמה בפתרון זה עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר (RT). למלא אחר מיכל הזכוכית עם קסילן טריים באותו אמצעי אחסון כמו 1.2.1. העברה, דגירה הרקמה בפתרון זה במשך 24 שעות ביממה ב- RT. במקום 100% אתנול לתוך צינור חרוטי באותו אמצעי אחסון כמו 1.2.1. העברה, דגירה הרקמה בפתרון זה במשך 24 שעות ביממה ב- RT. מקום 95% אתנול לתוך צינור חרוטי באותו אמצעי אחסון כמו 1.2.1. העברה, דגירה הרקמה בפתרון זה במשך 24 שעות ביממה ב- RT. במקום 70% אתנול לתוך צינור חרוטי באותו אמצעי אחסון כמו 1.2.1. העברה, דגירה הרקמה בפתרון זה במשך 24 שעות ביממה ב- RT. יש לשטוף הרקמה ב 0.01 M פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ומקום ב- PBS 0.01 M צינור חרוטי כדי equilibrate במשך 24 שעות ביממה במלון RT. ודא כי הרקמה הינה ללא פרפין (איור 1B, לוח נכון). 2. מכינים 4% Paraformaldehyde (PFA) מקבע פיפטה 10 מ ל-16% PFA לתוך צינור חרוטי 50-mL, להוסיף 4 מ ל 0.1 M PBS, ולהוסיף 26 mL לגלידה יונים (ddH2O). סוגרים את הפקק ומערבבים בקצרה. אחסון גדולים יותר של 4% PFA יכול להתבצע, אבל קפוא ב- aliquots. Aliquots הינם טובים ליום 1 בטמפרטורת החדר (RT), שבוע אחד ב 4 ° C, 1 חודש ב-20 ° C. 3. לבלב קיבוע לתקן את המדגם הלבלב (≤ 1 x 1 x 2 ס”מ) המוכנים באופן טרי 4% מחברים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. אם המדגם הוא גדול יותר מאשר 1 x 1 x 2 ס”מ, להשתמש באזמל או גילוח כדי מחלקים קטנים יותר חתיכות לא יותר מ 1 ס מ עבה. לשטוף לדגימות שלושה שינויים ל- PBS 0.01 M למשך לפחות 15 דקות כל כביסה ולאחסן בצינור צנטריפוגה 15 מ”ל ב- 0.01% מחברים/0.01 M PBS או 0.5% נתרן אזיד/0.01 M PBS עד השימוש. לאחר קיבוע, סעיף הרקמה למקטעים בעובי 1-2 מ מ, לצורך המשך עיבוד. השתמש vibratome כדי לסייע אפילו חלוקתה.הערה: המספר הסופי של מקטעים תיקבע בהתאם לגודל המדגם ההתחלתי. 4. להטביע את רקמת ב הידרוג להכין 200 מ של הפתרון מונומר 4% הידרוג paraformaldehyde (A4P1) אקרילאמיד/1% כדלקמן: במקום בקבוקון על הקרח בדלי על צלחת מערבבים מגנטי. ודא שהבקבוקון יושב במול ולאחר להוסיף פס מגנטי מערבבים. להוסיף את הפעולות הבאות לפי סדר: 147.8 mL ddH2O (4-8 ° C) קר, 20 מ ל 0.1 M PBS, פתרון אקרילאמיד של 40% (4-8 ° C) של 20 מ”ל קר, 12.2 mL 16% מחברים פתרון ו- 250 מ”ג VA-044 יוזם. לערבב את הפתרון הידרוג כולו עם פס מגנטי מערבבים לפחות 10 דקות ולהשאיר את הפתרון קרח לשלב הבא. הצב צינור חרוטי 15-mL בקרח ליד הבקבוק המכיל את הפתרון הידרוג. פיפטה 14 מ של מונומר פתרון לתוך הצינור, והוסף חתיכה אחת של דגימת הרקמות קבוע בעובי 1-2 מ מ. ואז קאפ ברכבת התחתית. תקופת דגירה המדגם בפתרון מונומר של 3 ימים 4 ° C, להגן מפני אור. Aliquot כל מונומר הפתרון הנותרים, חנות ב-20 ° C לשימוש עתידי. 5. דגה הפתרון מונומר, פולימריזציה של הידרוג הסר את החמצן של הפתרון מונומר הידרוג באמצעות גז N28. להכין דלי קרח ומניחים את הדגימה בפתרון מונומר הידרוג על קרח. לאסוף 2-3, אל תדאגי hypodermic מחטים לכל דגימה פרפין ו טיימר. להתחבר לאורך צינור למיכל חנקן כך החנקן יכולה לזרום. תוך שמירה על המדגם על קרח, בזהירות לנקב את הכובע של צינור חרוטי המכיל את הדגימה בצד אחד ולחץ על אחד מחט hypodermic דרך עד שהוא נמצא מתחת לפני השטח של הפתרון מונומר נוזלי. להשתמש במזרק נוסף ניקוב הנגדי של הכיפה, אך לא לאפשר לו להיות מתחת למים.הערה: המחט השני לפרוק את הצינור. לחבר את הצנרור ממיכל חנקן במזרק שקוע מתחת הידרוג והפעל לאט את החנקן עד זה מבעבע בהתמדה העובר בנוזל. לאפשר את החנקן בועה דרך הנוזל למשך 10 דקות. ברגע החמצן מוסר, במהירות להסיר שתי מחטים ולכסות את הכובע עם סרט פרפין כדי למנוע כל עוד חילופי גזים בין הצינור לסביבה. מקם את הדגימה degassed בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 h כדי פולימריזציה של הידרוג. 6. רקמות סליקה הכנת 500 מ”ל ניקוי פתרון (4% מרחביות ב- pH 8.5). ~ 300 מ של ddH2O, להוסיף 50 מ ל 0.1 M PBS ו- 20 גרם מרחביות אבקת תוך כדי ערבוב עם פס מגנטי מערבבים. להתאים את הפתרון באמצעות סודיום הידרוקסיד. וחומצת ל pH 8.5. הוסף ddH2O עד שאמצעי האחסון הסופי 500 מ”ל. לאחר הפילמור, תשפכו הידרוג עודף וזורקים אותו לתוך מיכל פסולת כימית. השתמש מגבת נייר כדי למחוק משם הידרוג מדגם ולמחוק בעדינות לתוך מיכל פסולת כימית. רחץ לדוגמה בחילופי 3-5 מ’ 0.01 PBS (נוזל שטיפת להשליך לתוך. פסולת כימית) למשך 15 דקות כל שלב שטיפה. להעביר את הדגימה לתוך צינור חרוטי 50-mL עם 40 מ של ניקוי מאגר. דגירה המדגם במאגר סליקה ב 37 מעלות צלזיוס ושנה מדגם למאגר סליקה טריים בכל יום אחר. יוצאים המדגם במאגר סליקה של 2-8 שבועות, בהתאם לגודל המדגם (~ 8 שבועות 3 מ”מ x 3 מ”מ x 3 מ מ לדוגמה) להבטחת פינוי תקין. לפקח על ניקוי רקמות, לעצור בסיום. ודא כי המדגם שלמאחה שקוף על-ידי החזקת אותו מול האור כדי לבדוק אם ניקוי נאות (בדרך כלל יישאר קצת שיזוף צביעה באזורים אקסוקרינית).הערה: דוגמה יתר שנוקה יופיע בלויים בקצוות, המרקם יהיה רך מאוד כאשר הרים עם מלקחיים. זה נפוץ עבור הדגימה לנקות לצר. כמו כן, הרקמה לא יהיה שקוף לחלוטין עד להציב הרכבה מדיה (להוסיף, איור 1C). 7. מספר Immunofluorescence לשטוף את הדוגמאות על מטרף-סל ד 60 ב RT ליום אחד עם 40 מ ל 0.01 M PBS שינוי למאגר טריים לעיתים קרובות (4-5 מאגר לשינויים, סה כ 40 מ”ל כל כביסה, שינוי כל h עד למכונה הסופי). תני לשטוף סופית את המשך בן לילה RT. להכין הסכם מכתים מאגר. כדי 500 מ”ל 0.01 M PBS, להוסיף אזיד הנתרן 50 מ”ג ו- 0.5 מ ל TritonX-100. מערבבים היטב. דגירה הדגימה עם נוגדנים העיקרי. להוסיף 2% נורמלי סרום (מאותו המין כמו הנוגדן המשני) להסכם הבסיסי מכתים המאגר בצינור בתחתית שטוח 2-mL (הנפח הכולל לפחות 1 mL מומלץ למחזור/המדגם). מוסיפים נוגדן ראשוני 2% הסרום/ההסכם מכתים מאגר. השתמש כ 5 x כמות נוגדנים העיקרי עבור ברית מכתים ישמש עבור תקן אימונוהיסטוכימיה (כלומר אם נוגדן היא שבערך מדולל עבור אימונוהיסטוכימיה רגיל, שימוש בטחונות עבור ברית מכתים). השתמש במרית כדי להסיר את הדגימה מתוך המאגר לשטוף, כי אמחה קלות את מאגר עודף חופש על גבי מגבת נייר ולאחר מכן למקם את הצינור עם פתרון נוגדן ראשוני. דגירה 2-4 ימים במלון RT-מטרף-60 סל ד. לשטוף ביסודיות דגימות ב RT-מטרף-60 סל ד ב- PBS 0.01 M שינוי למאגר טרי 4 – 5 פעמים, עוזב את השטיפה הסופית על לילה כמו שלב 7.1. דגירה בדגימות עם נוגדנים משניים. להוסיף 2% נורמלי סרום (מאותו המין כמו הנוגדן המשני) להסכם הבסיסי מכתים המאגר בצינור בתחתית שטוח 2-mL (הנפח הכולל של 1 מ”ל מומלץ למחזור/המדגם). להוסיף נוגדנים משניים ריכוז של 1:200 (5 µl במאגר 1 מ”ל).הערה: תבנית קטנה הם מועדף, כמו גם מאוד קרוס-הספוחה נוגדנים אם משתמש אחד או יותר נוגדן ראשוני. השתמש במרית כדי להסיר את הדגימה מהמאגר לשטוף, כי אמחה קלות את מאגר עודף חופש על גבי מגבת נייר ולאחר מכן למקם את הצינור עם פתרון נוגדנים משניים. דגירה ב RT-מטרף-סל ד 60 2 ימים ולהגן המדגם מהאור. רחץ את הדגימות בשלמות, כמו צעד RT-מטרף-60 סל ד ב- PBS 0.01 M שינוי למאגר טרי 4 – 5 פעמים ולהשאיר את הגמר 7.1, לרחוץ ב לילה, להגן מפני אור במהלך שוטף. 8. הרכבה את דגימות עבור הדמיה הכנת המאגר מתאימים פתרון (חישוקים) מקדם שבירה. שוקלים לצאת 11 גרם של צפיפות ללא יונית הדרגתיות בינונית (למשל, Histodenz) ולהעביר בזהירות ל צינור חרוטי 50-mL. הוסף ~ 5 מ ל ז 0.02 נקודות פוספט מאגר (PB)8 באמצעות מרית לשחרור אוויר מן המדיום הדרגתי של צפיפות ללא יונית אבקה.הערה: הפתרון יהיו מאוד צמיגה, מערבבים היטב. להביא את אמצעי האחסון 10 מ”ל באמצעות PB יותר, לערבב עם מרית, לגרד את עודף את המרית לתוך הצינור. דגירה טסות ב 37 ° C עד התפרקה, היפוך ולערבב בעדינות לפי הצורך. העברת דגימות לתוך חישוקים. כדי לעשות זאת, פיפטה 1 מ”ל חישוקים לתוך צינור שטוח התחתונה 2-mL. השתמש במרית כדי להסיר את הדגימה מהמאגר לשטוף, כי אמחה קלות את מאגר עודף חופש על גבי מגבת נייר ולאחר מכן למקם את הצינור עם חישוקים פתרון. טפח בעדינות את הצינור כדי להטביע את הדגימה ב חישוקים. מקום דגימות חישוקים על הספסל מוגן מפני אור ב RT עבור 2-4 ימים לפני הדמיה. תמונה, מקם כמות קטנה של המכון לתוך שקופיות הקאמרית 8-ובכן coverslip התחתון. רק להוסיף רק מספיק בשביל המעיל התחתון, יגרום יותר לדוגמה כדי לצוף מקשה על תמונה על טווח הפוכה. הוסף את הדגימה אל הבאר ‘ קאפ השקופית עבור הדמיה. 9. הדמיה מיקרוסקופיה קונפוקלית והדמיה תוכנה בחר לייזרים המתאימים עירור, ספקטרום הפליטה של fluorophores להשתמש כדי להכתים את הדגימות ברית. להתאים את ההגדרות של התוכנה רכישת כך כל חפיפה בין ערוצי חוסלה. השתמש מסלולים נפרדים במידת הצורך (כשיש fluorophores שני ספקטרה עירור דומה). להגדיר את רכישת התמונה בחר מהירות הרכישה המרבי, 16 סיביות, ממוצעים 4 או יותר, 1024 x 1024 החלטה ואף טוב יותר. זום לתוך העצם ליצירת תמונה.הערה: יפחת רכישת זמן כדי להפחית את הלבנת-צילום, גם להקטין את גודל הקובץ ועריכה במורד הזרם. הגדרת הערימה-z. בחר את חלוקתה אופטימלית עבור המטרה בשימוש. אם deconvolution רצוי מאוחר יותר, השתמש z-שלב קטן יותר אופטימלית כגון 1 מיקרומטר. השתמש את התיקון z-מחסנית. להתחיל הקרוב פני השטח של הרקמה, להגדיל את הרווח כמו המטרה מתמקדת דרך המישור z ולהוסיף תיקונים. אל תשנה את הגדרות לייזר על התיקון! רוכשים ערימה מבחן עם ממוצע אחד, 512 x 512 ברזולוציה של מהירות הרכישה המרבי. בדוק את התמונה ב- 3D כדי לוודא כי יש בהירות שווה לאורך כל הערימה לכל צבע לפני רכישת הסופי ברזולוציה גבוהה z-הערימה. הדמיה Lightsheet ודא כי הדגימות equilibrated ב חישוקים הדמיה לפחות 24 ח’ אידיאלי, להעביר את הדגימות חישוקים טריים בבית הבליעה הדמיה, מאפשרים equilibrate בבית הבליעה לפחות ליום. הר המדגם עבור הדמיה בחר את נימי (שחור) הקטן ביותר כדי לטעון את הדגימה השתמש מרק או תבשיל להחזיק את הדגימה תוך יישום דבק סופר לסוף נימי. הדבק את הרקמה נימי לגעת מעט משטח של הרקמה ככל האפשר. הכנס את הדגימה עבור הדמיה. התמונה באמצעות 5 X או מטרות X 25 מתאימים עבור דגימות שטיחות שנוקה באמצעות הציר סריקה אפשרות. אם הוספת צל או טשטוש מתרחשת, לסובב את הדגימה, לנסות שוב, או לתת את הדגימה להמשיך equilibrate ב חישוקים.הערה: ערימה 1 מ מ ניתן בדרך כלל לרכוש תוך פחות מחמש דקות, בהתאם להגדרות. הצגה ועריכה של אוספי תמונות באמצעות תוכנת ניתוח של התמונה.