Immagini 3D ad alta risoluzione della rete Neuro-insulari Pancreas umano

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la University of Florida Institutional Review Board e le linee guida federali. Attenzione: Paraformaldeide e acrilammide sono irritanti tossici. Reagenti in una cappa con appropriati dispositivi di protezione individuale (camice, guanti, occhiali di protezione). 1. Sparaffinatura dei tessuti formaldeide-fisso (se lavora con tessuti freschi, andare al passaggio 2) Utilizzare una nuova lama di rasoio o bisturi per tagliare attraverso la paraffina perpendicolare alla superficie del tessuto. Tagliare la paraffina al bordo del tessuto alla fine esso allentamento. Utilizzare pinze o una spatola per delicatamente allentare e rimuovere il tessuto otticamente essere liquidati. Raschiare delicatamente la paraffina in eccesso dal tessuto con una spatola (Figura 1A). Riempire un contenitore di vetro con xilene (circa 30 mL per un 3 x 3 x 3, sezione mm di tessuto) e incubare il tessuto in questa soluzione per 24 h a temperatura ambiente (TA). Riempire un altro contenitore di vetro con xilene fresco con lo stesso volume come 1.2.1. Trasferire e incubare il tessuto in questa soluzione per 24 h a TA. Inserire etanolo al 100% in una provetta conica con lo stesso volume come 1.2.1. Trasferire e incubare il tessuto in questa soluzione per 24 h a TA. Inserire un tubo conico con lo stesso volume come 1.2.1 di etanolo al 95%. Trasferire e incubare il tessuto in questa soluzione per 24 h a TA. Inserire un tubo conico con lo stesso volume come 1.2.1 di etanolo al 70%. Trasferire e incubare il tessuto in questa soluzione per 24 h a TA. Sciacquare il tessuto in 0,01 M di fosfato tampone salino (PBS) e posto in PBS 0,01 M in una provetta conica per equilibrare per 24 h a RT. Assicurarsi che il tessuto sia privo di paraffina (Figura 1B, pannello di destra). 2. preparare 4% paraformaldeide (PFA) fissativo Pipettare mL 10 16% PFA in una provetta conica da 50 mL, aggiungere 4 mL di PBS + 0.1 M e 26 mL di acqua distillata o deionizzata (ddH2O). Chiudere il tappo e mescolare brevemente. Volumi maggiori di 4% PFA può essere fatto in anticipo e congelato in aliquote. Le aliquote sono buone per 1 giorno a temperatura ambiente (TA), una settimana a 4 ° C e 1 mese a-20 ° C. 3. pancreas fissazione Correggere l’esempio del pancreas (≤ 1 x 1 x 2 cm) in preparati 4% PFA a 4 ° C per 48 h. Se il campione è più grande di 1 x 1 x 2 cm, utilizzare un bisturi o lametta per sezionare in piccoli pezzi non più di 1 cm di spessore. Lavare il campione di tessuto in tre cambi di PBS 0,01 M per almeno 15 min ogni lavaggio ed immagazzinare in provetta da centrifuga da 15 mL in 0,01% PFA/0,01 M PBS o 0,5% sodio azide/0,01 M PBS fino all’utilizzo. Dopo la fissazione, la sezione del tessuto in sezioni spesse 1-2 mm per l’ulteriore elaborazione. Usare una vibratome per assistere in anche di sezionamento.Nota: Il numero finale delle sezioni dipenderà la dimensione del campione iniziale. 4. incorporare tessuto in idrogel Preparare 200 mL di soluzione di monomero di 4% acrilammide/1% paraformaldeide (A4P1) idrogel come segue: Posto un pallone sul ghiaccio in un secchio sulla cima di una piastra magnetica. Accertarsi che il pallone sia seduto piatto e aggiungere un ancoretta magnetica. Aggiungere il codice seguente nell’ordine: 147,8 mL freddo (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL di PBS + 0.1 M, soluzione di acrilammide per 20ml fredda (4-8 ° C) 40%, 12,2 mL di soluzione di 16% PFA e iniziatore di 250 mg VA-044. Miscelare la soluzione intera idrogel con un ancoretta magnetica per almeno 10 min e lasciare la soluzione sul ghiaccio per il passaggio successivo. Inserire un tubo conico di 15 mL nel ghiaccio accanto alla beuta contenente la soluzione di idrogel. Pipettare 14 mL di soluzione di monomero nella provetta e aggiungere un pezzo del campione di tessuto fisso spesso 1-2 mm. Quindi richiudere la provetta. Incubare il campione nella soluzione di monomero per 3 giorni a 4 ° C e proteggere dalla luce. Aliquotare qualsiasi restante soluzione di monomero e conservare a-20 ° C per un uso futuro. 5. degassare la soluzione di monomero e polimerizzare l’idrogel Rimuovere l’ossigeno dalla soluzione di monomero di idrogel utilizzando gassosi N28. Preparare un secchio di ghiaccio e posizionare il campione nella soluzione di monomero di idrogel su ghiaccio. Raccogliere gli aghi ipodermici 18g 2-3, per esempio, pellicola di paraffina e un timer. Collegare il tubo al serbatoio di azoto affinché l’azoto può fluire. Pur mantenendo il campione sul ghiaccio, perforare con attenzione il tappo di una provetta contenente il campione su un lato e premere un ago ipodermico attraverso fino a quando è sotto la superficie della soluzione monomero liquido. Utilizzare un altro ago ipodermico per pungere il lato opposto della PAC, ma non permettono di diventare sommerso.Nota: Il secondo ago sarà sfiatare il tubo. Collegare il tubo dal serbatoio di azoto per l’ago ipodermico sommerso sotto l’idrogel e girare lentamente l’azoto fino a essa ribolle costantemente attraverso il liquido. Consentire l’azoto a bolla attraverso il liquido per 10 min. Una volta rimosso l’ossigeno, rimuovere entrambi gli aghi rapidamente e coprire il tappo con un film di paraffina per prevenire qualsiasi ulteriore scambio di gas tra il tubo e l’ambiente. Il campione degassato viene posto in un incubatore a 37 ° C per 3 h di polimerizzare l’idrogel. 6. i tessuti schiarimento Preparare 500 mL di soluzione (4% SDS a pH 8,5) di compensazione. A ~ 300 mL di ddH2O, aggiungere 50 mL 0.1 M PBS e 20 g SDS polvere continuando a mescolare con un ancoretta magnetica. Regolare la soluzione utilizzando idrossido di sodio e acido cloridrico a pH 8,5. Aggiungere ddH2O fino a quando il volume finale è di 500 mL. Dopo la polimerizzazione, levate l’eccesso idrogel e gettarlo in un contenitore per rifiuti chimici. Utilizzare un tovagliolo di carta per delicatamente pulire idrogel lontano dal campione e gettare in un contenitore per rifiuti chimici. Lavare il campione in 3-5 scambi di 0,01 M PBS (liquido di lavaggio scartare nei rifiuti chimici) per 15 min ogni passaggio di lavaggio. Trasferire il campione in una provetta conica da 50 mL con 40 mL di tampone di compensazione. Incubare il campione nel buffer di compensazione a 37 ° C e cambiare il campione al buffer di schiarimento freschi ogni altro giorno. Lasciare il campione nel buffer di compensazione per 2-8 settimane a seconda della dimensione del campione (~ 8 settimane per un 3 x 3 mm x 3 mm campione) per garantire la corretta compensazione. Monitoraggio schiarimento dei tessuti e l’arresto al termine. Assicurare che il campione sia adeguatamente trasparente tenendolo fino alla luce per verificare la corretta compensazione (di solito qualche colorazione conciare rimarrà nelle regioni esocrine).Nota: Un campione di over-eliminato apparirà sfilacciato ai bordi e la trama sarà molto morbida quando prelevati con il forcipe. È comune per il campione cancellare in modo non uniforme. Inoltre, il tessuto non sarà completamente trasparente fino a quando inserito nel montaggio supporti (inserire, Figura 1). 7. più immunofluorescenza Lavare i campioni su un agitatore a 60 giri/min a RT per un giorno con 40 mL di PBS 0,01 M cambiando a fresco buffer spesso (4-5 buffer cambia in totale, 40 mL di ogni lavaggio, cambiando ogni h fino a quando il lavaggio finale). Lasciare il lavaggio finale continuare tutta la notte a TA. Preparare il patto macchiatura buffer. Per 500 mL di PBS 0,01 M, aggiungere 50 mg sodio azide e 0,5 mL TritonX-100. Mescolare bene. Incubare il campione con gli anticorpi primari. Aggiungere 2% siero normale (stessa specie come l’anticorpo secondario) al patto di base macchiatura tampone in una provetta 2 mL fondo piatto (almeno 1 mL di volume totale è consigliato per campione/tubo). Aggiungere il 2% del siero/patto macchiatura buffer anticorpo primario. Utilizzare circa 5 volte la quantità di anticorpo primario per la colorazione del patto che viene utilizzata per immunohistochemistry standard (cioè se un anticorpo è diluito 1: 500 per immunohistochemistry standard, utilizzo 1: 100 per la colorazione del patto). Utilizzare una spatola per rimuovere il campione dal tampone di lavaggio e tamponare il tampone in eccesso su un tovagliolo di carta, poi posto nel tubo con una soluzione di anticorpo primario. Incubare per 2-4 giorni a temperatura ambiente in un agitatore a 60 giri/min. Lavare accuratamente i campioni a RT su un agitatore a 60 rpm in PBS 0,01 M cambiando a tampone fresco 4 – 5 volte e lasciando il lavaggio finale durante la notte come descritto al punto 7.1. Incubare i campioni con anticorpi secondari. Aggiungere 2% siero normale (stessa specie come l’anticorpo secondario) al patto di base tampone in una provetta 2 mL fondo piatto di colorazione (1 mL di volume totale è consigliato per campione/tubo). Aggiungere gli anticorpi secondari ad una concentrazione di 1: 200 (5 µ l in 1 mL di tampone).Nota: Piccolo formato gli anticorpi sono anticorpi preferiti, così come altamente cross-adsorbito in se utilizza più di un anticorpo primario. Utilizzare una spatola per rimuovere il campione dal tampone di lavaggio e tamponare il tampone in eccesso su un tovagliolo di carta, poi posto nel tubo con una soluzione di anticorpo secondario. Incubare a RT su un agitatore a 60 giri/min per 2 giorni e proteggere il campione dalla luce. Lavare accuratamente i campioni, come descritto al punto 7.1, a RT su un agitatore a 60 rpm in PBS 0,01 M cambiando nel buffer fresco 4 – 5 volte e lasciando la finale lavare tutta la notte, proteggere dalla luce durante i lavaggi. 8. esempi di montaggio per l’Imaging Preparare il tampone di soluzione abbinati (cerchi) di indice di rifrazione. Pesare 11 g di medio gradiente di densità non ionici (ad esempio, Histodenz) e trasferire con cautela in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere con una spatola per liberare l’aria dal mezzo di gradienti di densità non ionici polvere ~ 5 mL 0,02 M fosfato tampone (PB)8 .Nota: La soluzione sarà molto viscoso, mescolare bene. Portare il volume a 10 mL utilizzando più PB, mescolare con una spatola e raschiare l’eccesso fuori la spatola nella provetta. Cerchi di incubare a 37 ° C fino a completa dissoluzione, invertire e mescolare delicatamente come necessario. Trasferire campioni nei bordi. A tale scopo, Pipettare 1 mL cerchi in una provetta da 2 mL a fondo piatto. Utilizzare una spatola per rimuovere il campione dal tampone di lavaggio e tamponare il tampone in eccesso su un tovagliolo di carta, poi posto nel tubo con soluzione di cerchioni. Picchiettare delicatamente il tubo per immergere il campione in cerchi. Posizionare il campione in cerchi in panchina al riparo dalla luce a temperatura ambiente per 2-4 giorni prima di formazione immagine. Per realizzare l’immagine, mettere una piccola quantità di cerchi in una diapositiva di camera inferiore 8 pozzetti vetrino coprioggetti. Aggiungere solo quanto basta per rivestire la parte inferiore, più causerà il campione in float rendendo più difficile per l’immagine su un ambito invertito. Aggiungere il campione e la diapositiva per l’imaging di cap. 9. imaging Microscopia confocale e software di imaging Selezionare laser appropriato per l’eccitazione e spettri di emissione di fluorofori utilizzati a macchiare i campioni del patto. Regolare le impostazioni del software di acquisizione in modo che eventuali sovrapposizioni tra i canali sono eliminata. Se necessario utilizzare tracce separate (quando due fluorofori hanno spettri di eccitazione simili). Impostare l’acquisizione di immagini Scegliere la velocità massima di acquisizione, 16 bit, 4 o più medie e risoluzione 1024 x 1024 o superiore. Ingrandire l’oggetto essere imaged.Nota: Ciò farà diminuire il tempo di acquisizione per ridurre foto-candeggio e anche diminuire la dimensione del file e la modifica a valle. Programma di installazione lo z-stack. Selezionare il sezionamento ottimali per l’obiettivo utilizzato. Volendo poi deconvoluzione, utilizzare un z-passo inferiore a ottimale come 1 µm. Utilizzare la correzione dello stack z. Iniziare la superficie del tessuto più vicina e aumentare il guadagno come l’obiettivo mette a fuoco attraverso il piano z e aggiungere le correzioni. Non modificare le impostazioni di laser per la correzione! Acquisire una pila di prova con una media, la risoluzione di 512 x 512 e velocità massima di acquisizione. Controllare l’immagine in 3D per assicurarsi che ci sia uguale luminosità in tutto lo stack per ogni colore prima di acquisire il finale ad alta risoluzione z-stack. Lightsheet Imaging Assicurarsi che i campioni hanno stati equilibrati in cerchi per imaging per almeno 24 h. idealmente, trasferire i campioni freschi cerchi nella camera di imaging e permettono di equilibrare in aula per almeno un giorno. Inserire il campione per l’imaging Selezionare il più piccolo capillare (nero) per montare il campione Utilizzare mastice o un piatto per tenere il campione durante l’applicazione di colla super all’estremità del capillare. Incollare il tessuto per il capillare toccando come poco una superficie del tessuto come possibile. Inserire il campione per l’imaging. Immagine utilizzando 5 X o 25 X obiettivi adatti per opzione di analisi di campioni otticamente cancellati usando il perno. Se si verifica lo shadowing o sfocatura, ruotare il campione e riprovare o lasciare che il campione continuano a equilibrare in cerchi.Nota: Una pila di 1 mm può essere acquisita in genere in meno di cinque minuti, a seconda delle impostazioni. Visualizzare e modificare gli stack di immagine utilizzando il software di analisi di immagine.