Imagerie 3D à haute résolution du réseau Neuro-insulaire pancréas humain

Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives fédérales et de University of Florida Institutional Review Board. ATTENTION : Paraformaldéhyde et acrylamide sont irritants toxiques. Gérer des réactifs dans une hotte de laboratoire avec l’équipement de protection individuelle approprié (blouse, gants, lunettes de protection). 1. déparaffinage des tissus fixés formaldéhyde (si vous travaillez avec les tissus frais, passez à l’étape 2) Utiliser une lame de rasoir Neuve ou un scalpel pour couper à travers la paraffine perpendiculairement à la surface du tissu. Couper la paraffine au bord du tissu pour finir il desserrant. Utilisez pince ou une spatule pour doucement desserrer et enlever le tissu à déneiger optiquement. Grattez légèrement excédentaire paraffine du tissu à l’aide d’une spatule (Figure 1 a). Remplir un récipient en verre avec xylène (environ 30 mL pour un 3 x 3 x 3 mm de section de tissu) et incuber le tissu dans cette solution pendant 24 h à température ambiante (RT). Remplir un autre récipient en verre avec xylène fraîche avec le même volume que 1.2.1. Transférer et incuber le tissu dans cette solution pendant 24 h à température ambiante. Déposer 100 % d’éthanol dans un tube conique avec le même volume que 1.2.1. Transférer et incuber le tissu dans cette solution pendant 24 h à température ambiante. Placez l’éthanol à 95 % dans un tube conique avec le même volume que 1.2.1. Transférer et incuber le tissu dans cette solution pendant 24 h à température ambiante. Placez l’éthanol à 70 % dans un tube conique avec le même volume que 1.2.1. Transférer et incuber le tissu dans cette solution pendant 24 h à température ambiante. Rincer le tissu au phosphate 0,01 M solution saline tamponnée (PBS) et place dans du PBS 0,01 M dans un tube conique s’équilibrer pendant 24 h à RT. veiller à ce que le tissu est exempt de paraffine (Figure 1 b, panneau de droite). 2. préparer le fixateur de paraformaldéhyde (PFA) 4 % Pipeter 10 mL 16 % PFA dans un tube conique de 50 mL, ajouter 4 mL de 0.1 M PBS et 26 mL eau distillée et désionisée (ddH2O). Fermer le couvercle et mélanger brièvement. Plus gros volumes de 4 % PFA peut être faite en avance et congelés en portions. Aliquotes sont bons pour 1 jour à température ambiante (RT), une semaine à 4 ° C et 1 mois à-20 ° C. 3. pancréas Fixation Difficulté de l’échantillon de pancréas (≤ 1 x 1 x 2 cm) fraîchement préparés 4 % PFA à 4 ° C pendant 48 h. Si l’échantillon est plus grand que 1 x 1 x 2 cm, utiliser un scalpel ou une lame de rasoir à disséquer en petits morceaux pas plus de 1 cm d’épaisseur. Laver le tissu échantillon dans trois changements de 0,01 M PBS pendant au moins 15 min chaque lavage et stocker dans tube à centrifuger 15 mL au 0.01 % PFA/0,01 M PBS ou 0,5 % sodium azide/0,01 M PBS jusqu’à utilisation. Après fixation, article le tissu en coupes 1-2 mm d’épaisseur pour un traitement ultérieur. Utilisez un vibratome afin d’aider à la même section.Remarque : Le nombre final des sections dépendra de la taille de l’échantillon de départ. 4. incorporer les tissus en Hydrogel Préparez 200 mL de la solution de monomère de 4 % d’acrylamide/1 % paraformaldéhyde (A4P1) hydrogel comme suit : Placer un ballon sur la glace dans un seau sur le dessus une plaque magnétique remuer. Assurez-vous que le ballon est assise plate et ajouter un magnétique. Ajoutez le code suivant dans l’ordre : 147,8 mL froid (4 à 8 ° C) ddH2O, PBS de 0,1 M de 20 mL, solution de 20 mL froide (4 à 8 ° C) 40 % d’acrylamide, 12,2 mL de solution de PFA 16 % et initiateur 250 mg VA-044. Mélanger la solution entière hydrogel avec une barre magnétique remuer pendant au moins 10 min et laisser la solution sur la glace pour l’étape suivante. Placer un tube conique de 15 mL dans la glace à côté de la fiole contenant la solution de l’hydrogel. Pipeter 14 mL de solution de monomère dans le tube et ajouter un morceau de l’échantillon de tissu fixe épais de 1 à 2 mm. • Bouchon puis le tube. Incuber l’échantillon en solution de monomère pendant 3 jours à 4 ° C et protéger de la lumière. Aliquote toute solution de monomère restants et les conserver à-20 ° C pour une utilisation future. 5. dégazer la Solution de monomère et polymériser l’Hydrogel Retirer l’oxygène de la solution de monomère hydrogel utilisant gazeux N28. Préparez un seau de glace et placer l’échantillon dans la solution de monomère d’hydrogel sur la glace. Rassembler les 2-3, les aiguilles hypodermiques calibre 18 par exemple, film de paraffine et une minuterie. Raccordez le tuyau au réservoir d’azote pour que l’azote peut circuler. Tout en gardant l’échantillon sur la glace, percer avec précaution le bouchon d’un tube conique contenant l’échantillon sur un côté et appuyez sur une aiguille hypodermique dans jusqu’à ce qu’il est sous la surface de la solution de monomère liquide. Utiliser une autre aiguille hypodermique pour piquer le côté opposé de la PAC, mais ne lui permettent pas d’être submergés.Remarque : La deuxième aiguille ventile le tube. Raccordez le tuyau du réservoir d’azote à la seringue hypodermique submergée sous l’hydrogel et tourner lentement sur l’azote jusqu’à ce qu’elle bouillonne régulièrement à travers le liquide. Permettre à l’azote à bouillonner à travers le liquide pendant 10 min. Une fois que l’oxygène est enlevé, les deux aiguilles de sortir rapidement et le couvercle avec un film de paraffine pour éviter tout nouvel échange de gaz entre le tube et de l’environnement. Placer l’échantillon dégazé dans un incubateur à 37 ° C pendant 3 h à se polymériser l’hydrogel. 6. tissu Clearing Préparer 500 mL de solution (4 % SDS à pH 8,5) de compensation. À ~ 300 mL de ddH2O, ajouter 0,1 M 50 mL PBS et 20 g SDS en poudre, en remuant avec une barre d’agitation magnétique. Ajuster la solution à l’aide d’hydroxyde de sodium et acide chlorhydrique pH 8,5. Ajouter ddH2O jusqu’à ce que le dernier volume est de 500 mL. Après polymérisation, videz l’excès hydrogel et jetez-le dans un conteneur de déchets chimique. Utilisez une serviette en papier pour essuyer loin hydrogel de l’échantillon en douceur et jeter dans un conteneur de déchets chimique. Laver l’échantillon dans 3-5 circonscriptions de 0,01 M PBS (liquide de lavage jeter dans les déchets chimiques) pendant 15 minutes chaque étape de lavage. Transférer l’échantillon dans un tube conique de 50 mL avec 40 mL de tampon de compensation. Incuber l’échantillon dans le tampon de compensation à 37 ° C et remplacez échantillon fraîchement déboisé tampon tous les deux jours. Laisser l’échantillon dans le tampon de compensation pendant 2 à 8 semaines selon la taille de l’échantillon (environ 8 semaines pour un 3 x 3 mm x 3 mm échantillon) afin d’assurer une compensation appropriée. Surveiller la clairière de tissu et arrêter lorsque vous avez terminé. S’assurer que l’échantillon est suffisamment transparent en le tenant à la lumière pour vérifier la bonne compensation (généralement une coloration beige restera dans les régions exocrines).NOTE : Un échantillon trop effacée paraîtra usé sur les bords et la texture sera très douce quand ramassé avec une pince. Il est fréquent que l’échantillon effacer de façon inégale. En outre, le tissu ne sera pas entièrement transparent tant que placé dans le montage des médias (insérer, Figure 1). 7. plusieurs Immunofluorescence Laver les échantillons sur un agitateur à 60 tr/min à RT pendant une journée avec 40 mL 0,01 M PBS changeant à mémoire tampon fraîche souvent (change de tampon de 4-5 au total, 40 mL chaque lavage, changer toutes les heures jusqu’à ce que le lavage final). Laissez le lavage final continuer toute la nuit à température ambiante. Préparer le Pacte de tampon de coloration. PBS de 0,01 M 500 mL, ajouter l’azoture de sodium 50 mg et de 0,5 mL TritonX-100. Bien mélanger. Incuber l’échantillon avec l’anticorps primaires. Ajouter 2 % sérum normal (même espèce que l’anticorps secondaire) à la base Pacte coloration tampon dans un tube à fond plat de 2 mL (volume total d’au moins 1 mL est recommandé par exemple/tube). Ajoutez l’anticorps primaire au 2 % sérum/Pacte de tampon de coloration. Utilisez environ 5 x la quantité d’anticorps primaire pour la coloration du Pacte que servirait pour immunohistochemistry standard (c’est-à-dire si un anticorps est dilué 1/500 pour immunohistochemistry standard, utilisation au 1/100 pour la coloration du Pacte). Utilisez une spatule pour retirer le tampon de lavage de l’échantillon et tamponnez le tampon excédentaire hors sur une serviette en papier, puis placer dans le tube avec une solution d’anticorps primaire. Incuber pendant 2 à 4 jours à RT sur un agitateur à 60 tr/min. Laver soigneusement les échantillons à ta sur un agitateur à 60 t/mn dans du PBS 0,01 M changer de tampon frais 4 à 5 fois et en laissant le lavage final sur une nuit comme au point 7.1. Incuber les échantillons avec des anticorps secondaires. Ajouter 2 % sérum normal (même espèce que l’anticorps secondaire) à la base Pacte coloration tampon dans un tube à fond plat de 2 mL (volume total de 1 mL est recommandé par exemple/tube). Ajouter des anticorps secondaires à une concentration de 1 : 200 (5 µl dans 1 mL de tampon).NOTE : Petit format anticorps sont privilégiées, ainsi que fortement adsorbés à la croisée des anticorps si vous utilisez plus d’un anticorps primaire. Utilisez une spatule pour retirer l’échantillon du tampon de lavage et tamponnez le tampon excédentaire hors sur une serviette en papier, puis placer dans le tube avec une solution d’anticorps secondaire. Incuber à RT sur un agitateur à 60 tr/min pendant 2 jours et protéger l’échantillon de la lumière. Se laver soigneusement les échantillons, comme au point 7.1, à ta sur un agitateur à 60 t/mn dans du PBS 0,01 M changer fraîche dans la mémoire tampon de 4 – 5 fois et en laissant la finale laver dessus durant la nuit, protéger de la lumière au cours de lavages. 8. montage des échantillons pour l’imagerie Préparer le tampon de solution appariés (jantes) de l’indice de réfraction. Peser avec 11 g du milieu gradient de densité non ionique (p. ex., Histodenz) et transvaser avec soin dans un tube conique de 50 mL. Ajouter environ 5 mL 0,02 M phosphate tampon (PB)8 à l’aide d’une spatule pour libérer l’air depuis le milieu de gradient de densité non ioniques poudre.Remarque : La solution sera très visqueux, bien mélanger. Porter le volume à 10 mL à l’aide de PB plus, mélanger avec une spatule et grattez le surplus au large de la spatule dans le tube. Incuber à 37 ° C jusqu’à dissolution les jantes, inverser et mélanger délicatement au besoin. Transférer les échantillons dans les jantes. Pour ce faire, pipette 1 mL jantes dans un tube à fond plat 2 mL. Utilisez une spatule pour retirer l’échantillon du tampon de lavage et tamponnez le tampon excédentaire hors sur une serviette en papier, puis placer dans le tube avec la solution de jantes. Tapotez doucement le tube pour submerger l’échantillon dans les jantes. Placer les échantillons dans des jantes sur le banc à l’abri de la lumière à ta 2-4 jours avant d’imagerie. Pour l’image, placez une petite quantité de jantes dans une diapositive de chambre de fond 8 puits lamelle couvre-objet. Seulement ajouter juste assez pour recouvrir la partie inférieure, plus provoquera l’échantillon à flotteur rend plus difficile à l’image sur un champ inversé. Ajouter l’exemple dans le puits et le capuchon de la diapositive pour l’imagerie. 9. imagerie Microscopie confocale et logiciel d’imagerie Sélectionnez des lasers appropriés pour l’excitation et les spectres d’émission des fluorophores utilisés pour colorer les échantillons du Pacte. Ajustez les réglages du logiciel acquisition afin que tout chevauchement entre les canaux est éliminé. Utilisez des pistes séparées si nécessaire (lorsque deux fluorophores ont des spectres d’excitation similaire). Mettre en place l’acquisition d’images Choisissez la vitesse d’acquisition maximum, 16 bits, 4 ou plusieurs moyennes et résolution 1024 x 1024 ou plus. Zoomer sur l’objet à être photographié.Remarque : Ceci diminuera le temps d’acquisition pour réduire les photos-blanchiment et également diminuer la taille du fichier et le montage en aval. Installation de la pile-z. Sélectionnez la découpe optimale pour l’objectif utilisé. Si déconvolution est souhaitée par la suite, utiliser un z-pas plus petit qu’optimale comme 1 µm. Utilisez la correction z-pile. Commencer le plus proche de la surface du tissu et augmenter le gain que l’objectif se concentre dans le plan z et ajouter des corrections. Ne modifiez pas les paramètres laser pour la correction ! Acquérir une pile de test avec une moyenne, une résolution de 512 x 512 et vitesse d’acquisition maximale. Vérifier l’image en 3D pour s’assurer qu’il y a une luminosité égale tout au long de la pile pour chaque couleur avant d’acquérir la haute résolution finale z-pile. Imagerie Lightsheet S’assurer que les échantillons ont été équilibrées dans jantes d’imagerie pendant au moins 24 h. idéalement, transférer les échantillons pour jantes douce dans la salle d’imagerie et laisser se pour équilibrer dans la chambre pendant au moins une journée. Monter l’échantillon pour l’imagerie Sélectionnez le plus petit capillaire (noir) pour monter l’échantillon Appliquer du mastic ou un plat pour contenir l’échantillon tout en appliquant une colle super à l’extrémité du capillaire. Coller le tissu pour le capillaire touchant aussi peu une surface du tissu que possible. Insérer l’échantillon pour l’imagerie. Image à l’aide de 5 X ou 25 objectifs X adaptés pour échantillons optiquement dégagés à l’aide du pivot scan option. En cas d’occultation ou flou, faites tourner l’échantillon et réessayer ou laisser l’échantillon s’équilibrer en jantes.Remarque : Une pile de 1 mm en général peut être acquis qu’en moins de cinq minutes, en fonction des paramètres. Affichez et modifiez les piles de l’image en utilisant le logiciel d’analyse de l’image.