Текущий протокол описывает метод, по которому пользователи могут поддерживать жизнеспособность острый срез гиппокампа и корковые препаратов во время сбора данных магнитного резонанса микроскопии.
Этот протокол описывает процедуры, необходимые для поддержки нормальных метаболических функций мозга, острый срез препаратов во время сбора данных микроскопии магнитный резонанс (МР). Хотя это можно выполнять г-н коллекций на живых, подакцизным млекопитающих ткани, такие эксперименты традиционно были ограничены пределы резолюции и таким образом не способны визуализации микроструктуры ткани. И наоборот Мистер протоколы, которые удалось достичь микроскопических изображений требуется использование фиксированных образцов, чтобы удовлетворить потребность для статических, неизменные условия более длительные проверки раз. Текущий протокол описывает первый доступных MR технику, которая позволяет изображений образцов ткани жизни, млекопитающих в микроскопических резолюций. Такие данные имеют чрезвычайно большое значение для понимания как на основе патологии контраст изменения, происходящие на микроскопическом уровне влияние содержание макроскопических MR сканирования таких используемых в клинике. После такого понимания реализуется, методы диагностики с большей чувствительностью и точностью может быть превращено, который будет переводить непосредственно к ранее лечение заболеваний, более точного мониторинга терапии и улучшения результатов лечения пациентов.
Хотя описанные методики фокусируется на препараты срез мозга, протокол адаптируется к любой фрагмент подакцизным ткани учетом того, что изменения вносятся в газ и perfusate подготовку для удовлетворения конкретных метаболических потребностей ткани. Успешное выполнение протокола должно привести к жизни, острый срез препараты, которые exhibit MR распространения сигнала стабильности для периодов до 15,5 ч. Основными преимуществами нынешней системы над другими MR совместимый перфузии аппараты являются его совместимость с оборудованием микроскопии MR, необходимых для достижения выше разрешение изображения и способность обеспечить постоянный, непрерывный поток с тщательно регулируемые perfusate условий. Сокращенной пробы пропускная способность — это рассмотрение с этой конструкции, как кусочек ткани только один может быть imaged одновременно.
Как магнитно-резонансная томография (МРТ) системы неуклонно продвинулись прочностями поля все выше и выше, более подробную информацию о составе и состоянии живых тканей стали заметной. Несмотря на такие успехи оборудования Мистер изображений в резолюции достаточно для визуализации клеточных структур тканей еще не доступен в клинике. В результате сотовой уровне характеристики тканей должна быть выведен при рассмотрении содержание клинических сканирования. Такое определение требует знания эквивалентных процессов, почерпнутые из данных в модели систем, которые можно наблюдать непосредственно. Традиционно эти модели включают клетки от водных организмов, таких как Xenopus laevis ооцитов и Аплизия californica L7 нейрон1,2. Они были среди первых животных клеток, доступных для наблюдения с MR методами из-за их типично большой размер: примерно 1000 мкм и 300 мкм в диаметре, соответственно. Совсем недавно, достижений в области дизайна оборудования позволили для одной из крупнейших примеров mammalian клеток — α-двигательного нейрона — к записи образа, используя методы микроскопии MR на фиксированной ткани3,4. Хотя эти исследования продемонстрировали прямая визуализация млекопитающих клеточного материала с помощью MR, фиксированная образцы занятых существенно отличаются в их господин свойства из живой ткани и таким образом не может служить эквивалент представитель модель5, 6. Что еще более важно наблюдения MR контраст изменений, которые происходят в концерте с сложных биологических процессов требует живых образцов, которые могут быть возмущенных и измеряется в течение изображений эксперимента.
Для облегчения MR микроскопии исследования на живые ткани, протокол представлен, которая включает в себя коммерческие microimaging оборудования7 интерфейсом специально, совместимы, в родила Оксигенатор MR и перфузии устройство описано ранее8 . Уникальные преимущества этой конструкции включают возможности сотовой уровне резолюции тканей млекопитающих и точного контроля над содержанием растворенного газа и рН на сайте перфузии тканей. Кроме того в отличие от большинства экспланта MR исследований, которые прервать перфузии во время захвата изображений чтобы избежать артефактов потока, этот дизайн поддерживает использование непрерывного перфузии во время сбора данных, которое было показано для улучшения физиологического состояния изолированные тканей9,10. И наконец его закрытые записи камеры и ломтик сохранение оборудования помощи в снижения вероятности артефакты движения, которые могут возникнуть во время затяжной коллекции изображений.
В то время как текущий протокол описывает процедуры, подходящие для использования с острой гиппокампа и корковые ломтиками, точный контроль над perfusate метаболитов позволяет этой системы для размещения широкий спектр типов различных тканей и экспериментальных условиях. Ограничения этого дизайна включают в себя сокращение образца пропускной способности по сравнению с многослойная перфузии палатой11; Однако это ограничение можно преодолеть в будущем с использованием мульти катушки массивы.
Кроме того хотя описанная система может использоваться в горизонтальной или вертикальной конфигурации, текущий протокол особенности ее использования в вертикально, спектрометр 600 МГц. Любая система, способная исследований г-н microimaging — обычно узкие родила (≤6 см), спектрометры высокое поле (пола≥500 МГц) — разместятся описано оборудование Оксигенатор и перфузии. Однако изменения изображений катушки, градиент, зонд системы или других необходимых изображений оборудования занятых может потребовать изменений перфузии и г-н проверки параметров.
Текущий протокол описывает процедуры, необходимые для стандартных метаболических обслуживания острого мозга среза препаратов претерпевает магнитного резонанса микроскопии. Эта процедура является единственным способом в настоящее время доступны, что позволяет визуализации живых тканей млекопитающих с MR в резолюциях способный разрешать клетки. Хотя описанные условия perfusate разработанных специально для тканей центральной нервной системы, протокол является широко адаптируемым к любым способом жизни Подготовка тканей путем корректировки perfusate и газовых составляющих, а также скорость потока перфузии и температуры.
Наиболее распространенные проблемы возникнуть во время описанные процедуры включают в себя те относящиеся к сбоям в поставках метаболит. Осадков солей кальция может произойти внутри фаго при газообразных недостаточность вследствие сбоев в бикарбонат, буферизацию системы. Такие осадки может засорить линии перфузии и привести к повреждению тяжелых оборудования. Если преципитаты соли наблюдаются в perfusate, после Ассамблеи зонд, перфузии поток немедленно прекратить, отключив Перистальтический насос. Подтвердите наличие достаточных уровней бикарбоната натрия (4,37 г/2 Л) в perfusate, CO2 уровня (5,0%), поставок газа, и потока газа Карбоген (1/16 Л/мин) в водохранилище и Оксигенатор. Наконец убедитесь, что уровень pH стабилизируются в физиологическом диапазоне (7.3-7,4). В случае, если газ и pH уровень кислорода до сих пор не регулируется надлежащим образом, Обмен газа мембраны должны быть заменены.
Если фрагменты не проявляют стабильность сигнала в течение предполагаемого экспериментальной время-, убедитесь, что правильный химический присутствуют в фаго смеси и сохранить правильную осмотического давления (300 мОсм) и рН (7.3-7,4). Кроме того убедитесь, что Карбоген газ поставляется в perfusate водохранилище и Оксигенатор в 1/16 Л/мин. Если эти шаги не исправить perfusate условий, рекомендуется замена мембраны газообмена. Если не ткани стабильность достигается после устранения неполадок в perfusate условиях, рассмотрим уточнение хирургического протокола с упором на минимизации временной интервал между приложения урожай и перфузии тканей.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана от грантов от национальных институтов здравоохранения (низ 1R01EB012874-01) (1R21NS094061-01A1) (S10RR031637) и Национальный научный фонд (кооперативные соглашения № DMR-1157490) через национальные лаборатории высоких магнитного поля (NHMFL) дополнительно магнитно-резонансной томографии и спектроскопии (AMRIS) в оф и штата Флорида.
Perfusate Preparation | |||
Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Slice Preparation | |||
Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Perfusion System | |||
Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MR Imaging Hardware | |||
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |