L’attuale protocollo descrive un metodo mediante il quale gli utenti possono mantenere la vitalità delle preparazioni fetta hippocampal e corticale acuta durante la raccolta dei dati di microscopia a risonanza magnetica.
Questo protocollo descrive le procedure necessarie per supportare le normali funzioni metaboliche delle preparazioni fetta cerebrale acuto durante la raccolta dei dati di microscopia a risonanza magnetica (MR). Mentre è possibile eseguire il signor collezioni su tessuti di mammiferi viventi, asportato, tali esperimenti hanno tradizionalmente Stati vincolati da limiti di risoluzione e così sono in grado di visualizzare la microstruttura del tessuto. Al contrario, signor protocolli che hanno raggiunto la risoluzione dell’immagine microscopica ha richiesto l’uso di campioni fissati per rispondere all’esigenza per condizioni statiche, immutabile oltre i tempi di scansione lunga. L’attuale protocollo descrive la prima tecnica di MR disponibile che permette l’imaging dei campioni di tessuto vivente, mammiferi a risoluzioni al microscopio. Tali dati sono di grande importanza per la comprensione dei cambiamenti di contrasto come base di patologia che si verificano all’influenza di livello microscopico il contenuto di macroscopica signor scansioni come quelli utilizzati nella clinica. Una volta tale comprensione è realizzato, metodi diagnostici con una maggiore sensibilità e precisione possono essere sviluppati, che si traduca direttamente al trattamento di malattia precedente, più accurato monitoraggio della terapia e migliorare i risultati pazienti.
Mentre la metodologia descritta si concentra sulla preparazione di fetta di cervello, il protocollo è adattabile a qualsiasi fetta di tessuto asportato, dato che vengono apportate modifiche ai gas e perfusato preparativi per soddisfare specifiche esigenze metaboliche del tessuto. Corretta esecuzione del protocollo dovrebbe risultare in preparazioni di fetta living, acuta che presentano MR stabilità del segnale di diffusione per periodi fino a 15,5 h. I vantaggi primari del sistema attuale sopra altri apparecchi di perfusione compatibile MR sono la compatibilità con l’hardware di microscopia del signor necessario per ottenere il più alto immagini ad alta risoluzione e capacità di fornire un flusso costante e ininterrotto con attentamente condizioni di perfusato regolamentato. Campione ridotto throughput è una considerazione con questo disegno come affettare un solo tessuto può essere imaged in un momento.
Come sistemi di imaging a risonanza magnetica (MRI) hanno progredito costantemente a intensità di campo sempre più elevati, maggiori dettagli circa la composizione e lo stato dei tessuti viventi sono diventati riconoscibili. Nonostante tali progressi hardware, risonanza magnetica a risoluzioni sufficiente per visualizzare le strutture cellulari dei tessuti non è ancora disponibile nella clinica. Di conseguenza, caratteristiche di livello cellulare dei tessuti devono essere dedotto quando si considera il contenuto delle analisi cliniche. Tale inferenza richiede la conoscenza di processi equivalenti raccolte dai dati rilevati in sistemi modello che possono essere osservati direttamente. Tradizionalmente, questi modelli inclusi cellule da organismi acquatici come gli ovociti di Xenopus laevis e Aplysia californica L7 neurone1,2. Questi sono stati tra le prime cellule animali disponibili per l’osservazione con MR metodi per via delle loro dimensioni in maniera atipica: circa 1000 μm e 300 μm di diametro, rispettivamente. Più recentemente, i progressi nella progettazione hardware hanno permesso per uno dei più grandi esempi di cellule di mammifero — il α-motoneuroni — essere imaged utilizzando tecniche di microscopia di RM in tessuto fisso3,4. Mentre questi studi hanno dimostrato la visualizzazione diretta del materiale cellulare dei mammiferi utilizzando MR, i campioni fissi impiegati differiscono in modo significativo nelle loro proprietà di MR da tessuto vivo e così non possono servire come un equivalente modello rappresentativo di5, 6. Ancora più importante, osservare i cambiamenti di contrasto signor che si verificano in concerto con complessi processi biologici richiede campioni di vita che possono essere perturbati e misurati nel corso dell’esperimento imaging.
Per facilitare gli studi di microscopia del signor su tessuti viventi, un protocollo è presentato che comprende microimaging commerciale hardware7 interfacciato ad un costruito appositamente, signor compatibile, in foro ossigenatore e perfusione dispositivo precedentemente descritto8 . Vantaggi unici di questo disegno includono funzionalità di risoluzione a livello cellulare in tessuti di mammiferi e controllo di precisione sul contenuto di gas disciolto e pH presso il sito della perfusione tissutale. Inoltre, a differenza della maggioranza degli studi di MR espianto che interrompono l’aspersione durante acquisizione immagine per evitare artefatti di flusso, questo design supporta l’utilizzo di aspersione continua durante la raccolta di dati che è stato indicato per migliorare la condizione fisiologica di isolato tessuti9,10. Infine, gli aiuti di hardware chiuso registrazione camera e fetta-ritenzione nel ridurre la probabilità di artefatti da movimento che potrebbero altrimenti verificarsi durante prolungati collezione di immagini.
Mentre l’attuale protocollo descrive procedure appropriate per l’utilizzo con fettine ippocampali e corticali acute, un controllo preciso sui metaboliti di perfusato permette questo sistema di ospitare una vasta gamma di tipi di tessuti diversi e condizioni sperimentali. Limitazioni di questo disegno includono una riduzione nel rendimento del campione rispetto ad un multi-slice aspersione camera11; Tuttavia, questa limitazione può essere superata in futuro utilizzando le matrici multi-bobina.
Mentre il sistema descritto può essere impiegato in configurazioni sia orizzontale o verticale, l’attuale protocollo dispone inoltre, l’utilizzo in un orientamento verticale, spettrometro di 600 MHz. Qualsiasi sistema in grado di MR microimaging studi — in genere stretto-foro (≤ 6 cm), spettrometri ad alto campo (≥ 500 MHz) — ospiterà le apparecchiature ossigenatore e perfusione descritte. Tuttavia, le modifiche per la bobina di imaging, gradiente, sistema sonda o altro hardware di imaging essenziale impiegati possono richiedere alterazioni l’impianto di aspersione e parametri di scansione di MR.
L’attuale protocollo descrive le procedure necessarie per la manutenzione ordinaria metabolica delle preparazioni di fetta di cervello acuto sottoposti a microscopia a risonanza magnetica. Questa procedura è l’unico metodo attualmente disponibile che permette la visualizzazione di tessuti dei mammiferi viventi con il signor a risoluzioni in grado di risolvere le cellule. Mentre il perfusato condizioni descritte sono adattate specificamente ai tessuti del sistema nervoso centrale, il protocollo è ampiamente adattabile a qualsiasi modo di vivere preparazione dei tessuti mediante aggiustamenti di perfusato e gas costituenti, come pure la portata di perfusione e temperatura.
I più comuni problemi suscettibili di presentarsi durante le procedure descritte sono quelli correlati a errori nel rifornimento del metabolita. Precipitazione di sali di calcio può verificarsi all’interno del aCSF durante insufficienza gassoso a causa di errori nel sistema di buffering del bicarbonato. Tali precipitati possono ostruire le linee di perfusione e provocare danni all’hardware grave. Se sale precipitati sono osservate nel perfusato seguendo assieme sonde, cessare immediatamente di aspersione flusso disattivando la pompa peristaltica. Confermare la presenza di sufficienti livelli di bicarbonato di sodio (4,37 g/2L) nel perfusato, livelli di CO2 (5,0%) nel gas di alimentazione e flusso di gas di carbogen (1/16 L/min) in serbatoio e ossigenatore. Infine, di confermare i livelli di pH sono stabilizzati nella gamma fisiologica (7,3-7,4). Nel caso in cui i livelli di pH e gas di ossigeno ancora non sono regolati in modo appropriato, dovrebbe sostituire la membrana di scambio di gas.
Se le fette non esibiscono stabilità del segnale nel tempo-corso sperimentale previsto, confermare che il corretti costituenti chimici sono presenti nella miscela aCSF e che siano mantenute le corrette osmolalità (300 mOsm) e pH (7,3-7,4). Inoltre, assicurarsi di carbogen gas viene fornita per il contenitore del perfusato e ossigenatore a 1/16 L/min. Se questi passaggi non si corregge il perfusato condizioni, sostituzione della membrana di scambio di gas è consigliato. Se la stabilità dei tessuti non viene raggiunta dopo la risoluzione dei problemi le condizioni di perfusato, considera la raffinatezza del protocollo chirurgico con un focus su riducendo al minimo l’intervallo di tempo tra l’applicazione di vendemmia e l’aspersione del tessuto.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (NIH 1R01EB012874-01) (1R21NS094061-01A1) (S10RR031637) e la National Science Foundation (accordo cooperativo No. DMR-1157490) attraverso l’impianto di laboratorio nazionale di campo magnetico alta (NHMFL) avanzate Magnetic Resonance Imaging e spettroscopia (AMRIS) UF e dello stato della Florida.
Perfusate Preparation | |||
Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Slice Preparation | |||
Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Perfusion System | |||
Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MR Imaging Hardware | |||
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |