Het huidige protocol beschrijft een methode waarmee gebruikers levensvatbaarheid van acute hippocampal en corticale segment preparaten tijdens het verzamelen van magnetische resonantie microscopie gegevens handhaven kunnen.
Dit protocol beschrijft de procedures noodzakelijk ter ondersteuning van normale metabolische functies van acute hersenen segment preparaten tijdens het verzamelen van magnetische resonantie (MR) microscopie gegevens. Hoewel het mogelijk is voor het uitvoeren van MIJNHEER collecties op levend, verwijderde zoogdieren weefsel, dergelijke experimenten hebben traditioneel is beperkt door de grenzen van de resolutie en zijn daardoor niet in staat van het visualiseren van weefsel microstructuur. Omgekeerd, MIJNHEER protocollen die hebben bereikt microscopische beeldresolutie vereist het gebruik van vaste monsters aan de noodzaak voor statische onveranderlijke omstandigheden over langdurige cyclustijden. Het huidige protocol beschrijft de eerste beschikbare heer techniek waarmee beeldvorming van levende, zoogdieren weefselsteekproeven op microscopische resoluties. Dergelijke gegevens is van groot belang voor het begrip van hoe pathologie gebaseerde contrast veranderingen die zich voordoen op de microscopische niveau invloed wordt de inhoud van macroscopische heer scans zoals die in de kliniek gebruikt. Zodra dergelijke inzicht wordt gerealiseerd, diagnostische methoden met grotere gevoeligheid en nauwkeurigheid kunnen worden uitgewerkt, dat rechtstreeks naar de behandeling van de ziekte van de oudere, meer accurate therapie monitoring en betere geduldige resultaten zal vertalen.
Hoewel de beschreven methodologie richt zich op de hersenen segment preparaten, is het protocol aanpasbaar aan elk segment van het verwijderde weefsel gezien het feit dat wijzigingen worden aangebracht in de gas- en perfusaat voorbereidingen om het weefsel van specifieke metabole behoeften tegemoet te komen. Succesvolle uitvoering van het protocol zou moeten resulteren in levensomstandigheden, acute segment preparaten die MIJNHEER diffusie signaal stabiliteit voor periodes tot 15,5 h vertonen. De belangrijkste voordelen van het huidige systeem over andere heer compatibel perfusie toestellen zijn de verenigbaarheid ervan met de heer microscopie hardware nodig om te bereiken hoger resolutiebeelden en mogelijkheid tot het bieden van constante, ononderbroken stroom met zorgvuldig gereglementeerde perfusaat voorwaarden. Deelmonster doorvoer is een overweging met dit ontwerp als slechts één weefsel segment kan image worden gemaakt op een moment.
Magnetische resonantie beeldvorming (MRI) systemen hebben gestaag vorderde aan steeds hogere Veldsterkten, meer details over de samenstelling en de status van levende weefsels geworden waarneembaar. Ondanks de vooruitgang van dergelijke hardware is MIJNHEER denkbaar ter resoluties voldoende te visualiseren de cellulaire structuren van weefsels nog niet beschikbaar in de kliniek. Mobiele-niveau kenmerken van weefsels moeten dientengevolge worden afgeleid wanneer het overwegen van de inhoud van klinische scans. Dergelijke gevolgtrekking vereist kennis van gelijkwaardige processen die verkregen wordt uit de gegevens die in modelsystemen die rechtstreeks kunnen worden waargenomen. Traditioneel, deze modellen opgenomen cellen van aquatische organismen zoals de Xenopus laevis oöcyt en Aplysia californica L7 neuron1,2. Deze behoorden tot de eerste dierlijke cellen beschikbaar voor observatie met MIJNHEER methoden als gevolg van hun opslagruimte groot: ongeveer 1000 μm en 300 μm diameter, respectievelijk. Meer recentelijk, voorschotten in hardwareontwerp hebben toegestaan voor één van de grootste voorbeelden van zoogdiercellen — het α-motor neuron — aan het image worden gemaakt met behulp van MIJNHEER microscopie technieken op vaste weefsel3,4. Terwijl deze studies aangetoond directe visualisatie van zoogdieren celmateriaal met behulp van de heer dat, de vaste monsters dienst hun heer eigenschappen van levend weefsel aanzienlijk afwijken en dus niet kunnen dienen als een gelijkwaardige representatieve model5, 6. Wat nog belangrijker is, vereist MIJNHEER contrast veranderingen die zich in concert met complexe biologische processen voordoen observeren levende voorbeelden die kunnen worden verstoord en gemeten in de loop van de beeldvorming experiment.
Om te vergemakkelijken de heer microscopie studies over levende weefsels, wordt een protocol gepresenteerd waarin commerciële microimaging hardware7 geïnterfacet op een speciaal gebouwde, MIJNHEER compatibel, in-boring oxygenator en perfusie apparaat eerder beschreven8 . Unieke voordelen van dit ontwerp bevatten mogelijkheden voor mobiele-niveau probleemoplossing in zoogdieren weefsels en controle van de precisie over opgeloste gasinhoud en pH op de site van perfusie van het weefsel. Ook, in tegenstelling tot de meerderheid van explant heer studies die perfusie tijdens Beeldacquisitie om te voorkomen dat artefacten van de stroom te onderbreken, dit ontwerp ondersteunt het gebruik van continue perfusie tijdens het verzamelen van gegevens waarvan is aangetoond dat het verbeteren van de fysiologische toestand van geïsoleerd weefsels9,10. Tot slot, de hulp van de gesloten opname kamer en segment-retentie de hardware in het verminderen van de kans van beweging artefacten die anders kunnen ontstaan tijdens langdurige foto collectie.
Terwijl het huidige protocol procedures die geëigend zijn voor gebruik met acute hippocampal en corticale segmenten beschrijft, zorgt precieze controle over perfusaat metabolieten dit systeem voor een breed scala aan verschillende weefseltypes (HLA) en experimentele omstandigheden. Beperkingen van dit ontwerp bevatten een vermindering in monsters worden verwerkt in vergelijking met een multi segment perfusie kamer11; Nochtans, kan deze beperking worden overwonnen in de toekomst het gebruik van meerdere spoel arrays.
Ook, terwijl het beschreven systeem kan worden gebruikt in zowel horizontale of verticale configuraties, het huidige protocol beschikt over het gebruik ervan in een verticaal georiënteerd, 600 MHz spectrometer. Elk systeem staat van heer microimaging studies — meestal smal-boring (≤6 cm), hoge veld (≥500 MHz) spectrometers — geschikt is voor de apparatuur van het oxygenator en perfusie beschreven. Wijzigingen in de beeldvorming spoel, verloop, sonde systeem of andere essentiële imaging hardware werkzaam kunnen echter wijzigingen in de apparatuur perfusie en parameters van de scan van de heer vergen.
Het huidige protocol beschrijft procedures voor standaard metabole onderhoud van acute hersenen segment preparaten magnetische resonantie microscopie ondergaan. Deze procedure is de enige methode die momenteel beschikbaar waarmee de visualisatie van levende zoogdieren weefsels met MIJNHEER bij resoluties staat te oplossen van cellen. Terwijl het perfusaat voorwaarden beschreven worden zijn speciaal afgestemd op centrale zenuwstelsel weefsels, het protocol is sterk aan te passen aan een manier van leven weefsel voorbereiding door aanpassingen van perfusaat en gas-bestanddelen, alsmede perfusie debiet en temperatuur.
De meest voorkomende problemen kunnen worden ondervonden tijdens de beschreven procedures omvatten die verband houden met fouten in het aanbod van de metaboliet. Neerslag van calciumzouten kan optreden binnen de aCSF tijdens de gasvormige insufficiëntie ten gevolge van storingen in het systeem buffer bicarbonaat. Dergelijke precipitaten kunnen verstoppen de perfusie-lijnen en leiden tot beschadiging van de ernstige hardware. Als zout precipitaten worden waargenomen in het perfusaat na montage van de sonde, ophouden perfusie stroom onmiddellijk door het uitschakelen van de peristaltische pomp. Aanwezigheid van voldoende natriumbicarbonaat niveaus (4,37 g/2 L) in perfusaat, CO2 niveaus (5,0%) in levering gas en carbogen gasstroom (1/16 L/min) in zowel reservoir en oxygenator bevestigen. Tot slot bevestigen pH niveaus zijn gestabiliseerd in de fysiologische bereik (7.3-7.4). In het geval dat zuurstof gas- en pH-niveaus zijn nog niet op de juiste manier geregeld, moet de gasuitwisseling membraan worden vervangen.
Als segmenten in de beoogde experimentele tijd-loop geen signaal stabiliteit vertonen, bevestigen dat de juiste chemische bestanddelen in het aCSF mengsel aanwezig zijn en dat de juiste osmolaliteit (300 mOsm) en de pH (7.3-7.4) worden gehandhaafd. Controleer ook carbogen gas wordt geleverd aan het perfusaat reservoir en oxygenator op 1/16 L/min. Als deze stappen niet de juiste perfusaat voorwaarden, wordt vervanging van de gasuitwisseling membraan geadviseerd. Weefsel stabiliteit, niet wordt bereikt na het oplossen van problemen met het perfusaat voorwaarden Overweeg verfijning van het chirurgische protocol met een focus op het minimaliseren van het tijdsinterval tussen weefsel oogst en perfusie toepassing.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637), en de National Science Foundation (samenwerkingsovereenkomst nr. DMR-1157490) via de faciliteit van het nationale laboratorium voor hoog magnetisch veld (NHMFL) geavanceerde Magnetic Resonance Imaging en spectroscopie (AMRIS) op UF en de staat Florida.
Perfusate Preparation | |||
Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Slice Preparation | |||
Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Perfusion System | |||
Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MR Imaging Hardware | |||
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |