JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Metabolik destek çıkardım, yaşam beyin dokuları manyetik rezonans mikroskobu Alım sırasında

Published: October 18, 2017
doi:
10.3791/56282
, , , ,
1Department of Neuroscience,University of Florida, 2McKnight Brain Institute,University of Florida, 3Department of Biomedical Engineering,University of Florida, 4Center for Functionally Integrative Neuroscience,Aarhus University, 5Department of Radiology,University of Florida, 6National High Magnetic Field Laboratory,Florida State University

Summary

Geçerli protokol tarafından kullanıcılar manyetik rezonans mikroskobu veri toplanması sırasında akut Hipokampal ve kortikal dilim hazırlıklar canlılığı koruyabilirsiniz yöntemi açıklanır.

Abstract

Bu iletişim kuralı manyetik rezonans (MR) mikroskopi veri toplanması sırasında akut beyin dilim hazırlıkların normal metabolik işlevleri desteklemek için gerekli yordamlar açıklanır. Bay koleksiyonları yaşayan, eksize memeli doku üzerinde gerçekleştirmek mümkün iken, tür deneyler geleneksel olarak çözünürlük sınırları ile kısıtlı ve böylece doku Mikroyapı görselleştirme aciz. Diğer taraftan, mikroskobik görüntü çözünürlüğü elde ettin Bay protokolleri uzun inceden inceye gözden geçirmek kere üzerinden statik, değişmeyen koşulları için ihtiyacı karşılamak için sabit örnekleri kullanımını gerekli. Geçerli protokol yaşayan, memeli doku örneklerinin mikroskobik çözünürlüklerde görüntüleme sağlayan ilk kullanılabilir Bay teknik anlatılmaktadır. Bu verilerin mikroskobik düzeyde etkisi nasıl patoloji tabanlı kontrast değişimleri olanlar gibi makroskopik Bay inceden inceye gözden geçirmek içeriğini klinikte kullanılan anlamak için büyük önem taşıyor. Bir kez böyle bir anlayış fark, daha fazla hassasiyet ve doğruluk ile tanı yöntemleri, hangi doğrudan önceki hastalığı tedavi, daha doğru tedavi izleme ve geliştirilmiş hasta sonuçları için tercüme edecek geliştirilebilir.

Açıklanan metodoloji beyin dilim hazırlıkları üzerinde duruluyor olsa da, verilen bu doku’nın belirli metabolik ihtiyaçlarını karşılamak için gaz ve perfusate hazırlıkları yapılan değişiklikler herhangi bir çıkarılan doku dilime uyarlanabilir kuralıdır. Protokolü’nün başarılı yürütme 15,5 s kadar bir süre için Bay Difüzyon sinyali istikrar sergi yaşayan, akut dilim müstahzarları sonuçlanmalıdır. Diğer Bay uyumlu perfüzyon çizgisel geçerli sisteminin birincil avantajları ile daha yüksek çözünürlük fotoğraf ve sürekli, kesintisiz akışı ile dikkatli bir şekilde sağlamak için yetenek ulaşmak için gerekli Bay mikroskobu donanım uyumluluğunu edilmektedir Düzenlenmiş perfusate koşulları. İndirimli örnek işlem hacmi ile bu tasarım bir göz sadece bir doku dilim teker teker görüntüsü gibidir.

Introduction

Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) sistemleri giderek her zamankinden daha yüksek alan güçlü için ilerledikçe, kompozisyon ve yaşam dokuları durumu hakkında daha fazla ayrıntı discernable haline gelmiştir. Bu tür donanım gelişmeler rağmen Bay dokuların hücresel yapılar görselleştirmek için yeterli çözünürlükte görüntüleme klinikte değil bulunmaya devam eder. Sonuç olarak, hücresel düzeyinde özellikleri dokuların klinik tarar içeriği dikkate alınarak anlaşılmaktadır olabilir gerekir. Tür çıkarımı doğrudan gözlenen modeli sistemlerinde alınan veriler panoda eşdeğer işlemlerin bilgisi gerektirir. Geleneksel olarak, bu modeller Xenopus laevis oosit ve Aplysia californica L7 nöron1,2gibi suda yaşayan organizmalar hücrelerden dahil. Bunlar arasında atipik büyük büyüklükleri nedeniyle Bay yöntemleri ile gözlem için ilk ve hayvan hücrelerinin işaret edildi: yaklaşık 1000 mikron ve 300 mikron çapında, anılan sıraya göre. Daha yakın zamanlarda, donanım tasarımı gelişmeler memeli hücreleri en büyük örneklerinden biri için izin verdiğiniz — α-motor nöron — Bay mikroskobu teknikleri kullanarak sabit doku3,4üzerinde yansıması için. Bu çalışmalar memeli hücresel malzemenin Bay kullanarak doğrudan görselleştirme gösterdi, istihdam sabit örnekleri üzerinden canlı dokuya veriyoruz Bay özellikleri önemli ölçüde farklı ve böylece bir eşdeğer temsilcisi modeli5hizmet edemez, 6. Daha da önemlisi, karmaşık biyolojik süreçleri ile uyum içinde meydana gelen Bay kontrast değişiklikler gözlemleyerek tedirgin ve görüntüleme deneyi boyunca ölçülen yaşam örnekleri gerektirir.

Bay mikroskopisi çalışmaları canlı dokular üzerinde kolaylaştırmak için bir protokol olan ticari microimaging donanım7 bir amaca, Bay uyumlu, geçişli oxygenator ve daha önce açıklanan perfüzyon aygıt8 için arabirim içerir sunulur . Bu tasarım benzersiz avantajları hücresel düzeyde çözümleme becerisi memeli doku ve çözünmüş gaz içeriği ve doku perfüzyon yerinde pH hassas kontrol. Ayrıca, perfüzyon akışı eserler önlemek için resim alma sırasında kesintiye explant Bay çalışmalar çoğunun aksine, bu tasarım fizyolojik durumunu iyileştirmek için gösterilen veri toplama sırasında sürekli perfüzyon kullanımını destekler doku9,10izole. Son olarak, aksi takdirde sırasında meydana gelebilecek hareket eserler olasılığını azaltarak, kapalı kayıt odası ve dilim-saklama donanım yardım resim koleksiyonu uzamış.

Geçerli protokol akut Hipokampal ve kortikal dilimleri ile kullanmak için uygun yordamlar açıklanır iken, çeşitli doku tipleri ve deneysel koşullar geniş bir dizi karşılamak için bu sistemi perfusate metabolitleri üzerinde tam denetim sağlar. Bu tasarım sınırlamaları örnek işlem hacmi ile karşılaştırıldığında çok dilim perfüzyon odası11bir azalma dahil; Ancak, bu sınırlamayı gelecekte çoklu bobin dizileri kullanarak aşmak.

Ayrıca, açıklanan sistem içinde yatay veya dikey biçim istihdam edilebilir olsa da, geçerli iletişim kuralı kullanımı dikey olarak yönlendirilmiş bir 600 MHz Spektrometre ile bulunmaktadır. Bay microimaging çalışmaları herhangi bir sistemi — genellikle dar-geçişli (≤6 cm), yüksek alan (≥500 MHz) Spektrometreler — açıklanan oxygenator ve perfüzyon ekipman uygun büyüklükte. Ancak, değişiklikleri görüntüleme bobin, degrade, sonda sistemi veya diğer temel görüntüleme donanım istihdam perfüzyon ekipman ve Bay tarama parametreleri için değişiklik gerekli.

Protocol

açıklanan tüm hayvan deneyleri ileri Bilimler Ulusal akademiler içinde belirlenen yönergeleri izleyin ' bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanım kılavuzu ve gözden geçirilmiş ve Florida Üniversitesi tarafından onaylanmış ' s Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (IACUC). Ne zaman hayvan konu araştırma yapan tüm ilgili kurallar ve Yönetmelikler takip. 1. hazırlık Perfusate merkezi sinir sistemi dokuların bakım için yapmak taze yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF). Bikarbonat arabelleğe alınmış aCSF perfusate 2 L oluşturmak, 1500 mL 4 L şişesi iki katı damıtma ya da Ters Ozmos tarafından arıtılmış su dışarı ölçmek için . Bir manyetik heyecan bar şişeye koyun ve bir heyecan tabak kullanarak sıvı kışkırtmak. Tuzları aşağıdaki miktarlarda arıtılmış suya dağıtılması: 14,03 g (120 mM) Sodyum Klorür, 4.37 g (26 mM) sodyum bikarbonat, 0,41 g (1.5 mM) yem mono potasyum fosfat, 0.69 g (1.4 mM) Magnezyum sülfat heptahydrate, 0,59 g (2 mM) kalsiyum klorür dihydrate, Potasyum klorür 0,45 g (3 mM) ve 3.6 g (10 mM) glikoz. Not: Perfusate kimyasal içeriği doku ve deneme istenen şartları belirli metabolik gereksinimlerine bağlı olarak değişir. Tüm tuzları eriyene kadar Bu çözüm iyice karıştırın. 2 M’ye ek arıtılmış su kullanarak ses seviyesini. Bir donma noktası depresyon osmometer kullanarak aCSF osmolalite sınayın. 300’e ayarlayın mOsm/kg sorbitol kullanarak. 324 mg sorbitol 299 mOsm/kg aCSF perfusate 2 L için eklenmesi osmolalite 300 mOsm/kg (324mg başına yaklaşık 1 mOsm) artacak. Not:-Ebilmek var olmak stok aCSF 24 h aşmayacak şekilde bir süre için hava geçirmez, kapalı bir şişede 4 ° C’de 2. Perfüzyon sistemi kadar aCSF perfusate hazırlanın. Equilibrate aCSF doğrudan 1 h. az köpüren ile % 95’i carbogen (% 95’i O 2, % 5 CO 2; 1/16 L/dak) gaz sırasında ortam sıcaklığı (~ 23 ° C) için Not: Farklı doku türlerine veya istenen deneysel koşullar perfusate sıcaklık ya da gaz içerikleri düzeltilmesi gerekebilir. Perfusate içeriğinde çözünmüş gaz için istenen koşullar tam olarak bireysel bileşenleri tedarik gazı ( şekil 1) yüzde konsantrasyonları değişen tarafından denetlenebilir. Gerekli sıcaklık ve carbogen doygunluk, aCSF ulaştıktan sonra pH (7,3-7,4) fizyolojik aralıkta olduğunu doğrulayın. Kabarcık gaz için doğrudan perfusate göle (1/16 L/dak) uygun çözünmüş oksijen içerik ve pH sağlıklı doku metabolizması için elverişli koşulları sağlamak için deneme ders boyunca devam. Perfüzyon satırları Başbakan. Giriş tüp bağlı Peristaltik mikro-pompa için hazırlanmış aCSF (300 mOsm, pH 7,3-7,4, sürekli olarak benzin) Submerge. Pass oxygenator aygıt ( Şekil 2) ve perfüzyon satırları iki mıknatıs taşıyordu ve degrade bobin (yukarıdan aşağıya) yığını ve bobinleri bir kenara sonda derleme kadar ayarla. Herhangi bir aCSF atık yakalamak için oxygenator bir ölçek üzerinde asmak. Not: MRG sistemi tasarımına bağlı olarak, perfüzyon satırları mıknatıs Geçişli ve degrade bobinler veya sonda vücut yoluyla aCSF sistemiyle priming önce temel geçirilmesi gerekebilir. O perfüzyon satır yerleşim değil ilişmek sonda vücut veya astar yordama başlamadan önce sonda içine ekleme delik Meclisi onaylayın. İstenen Debi (2 mL/dk) seçili onaylayın ve perfüzyon satırları pompa geçiş yaparak doldurma başlamak. ACSF içinde bulunan hava yerinden böylece boş, satır içi kabarcık tuzak Invert. Oxygenator bağlanmak ' s ve gaz carbogen (bir manifold veya ikincil carbogen Silindir) ikinci bir kaynak bağlantı noktasına bir akış hızı 1/16 L/dak, ayarla o carbogen oxygenator akan onaylamak ' egzoz bağlantı noktası oxygenator üstüne suya daldırma tarafından s gaz değişimi membran. ACSF perfüzyon odasından damlayan algılandığında, herhangi bir görünür gaz kabarcıkları giriş akımı satırlarından el ile ajitasyon tarafından tasfiye. Onaylamak oxygenator doğru perfüzyon odasından akan aCSF oksijen elektrot batış tarafından çalışıyor. Not: Oksijen metre üzerinde okuma sağlanan gaz içinde bulunan oksijen yüzdesi yaklaşık. 3. Doku hazırlık ötenazi bir anestezi makine ve açmak için bir oksijen taşıyıcı %4 isoflurane indüksiyon odası bir fareye (125-150 g) gaz 1 L/dk 4 dakika süreyle oranında yer Bilinçsiz sıçan anestezi odasından kaldırın. Sırtüstü pozisyonda fareyi yerleştirerek iyileştiren bir refleks testi gerçekleştirin. Kontrol herhangi bir hareket için — baş dönüm, bacak kaldırma, omurga esneme, vb — hayvan onun mide dönüyor göstergesi. Bir pamuklu çubukla kullanarak hayvan açık göz dokunarak bir göz yanıp sönme yansımalı testi gerçekleştirin. Kontrol için herhangi bir yanıt — kapak kapatma, kas seğirmesi, vb — için bu duyusal girdi. Son olarak, gerçekleştirmek bir uzuv çekilme-refleks testi farenin ayak parmakları arasında cilt pinching tarafından ' s cımbız veya hemostats kullanarak arka bacak uzanmış. Kontrol bacaktaki fleksiyon için Not: söz konusu olduğunda bir pozitif yansımalı test sonucu, ötenazi ile devam etmeyin. Herhangi bir üç refleks testi aydınlığa çıkartıyor olay bu yanıt, fare hemen anestezi odasına dönün ve % 4 isoflurane maruz bir ek 2 min için izin. Tam olarak tüm üç yansımalı sınamaları gerçekleştirin. 2 dk anestezi pozlama gerektiği gibi yineleyin ve sonra yanıt-e doğru tüm üç yansımalı testi tam bir eksikliği gözlenen sadece devam etmek. Fareyi Giyotin işten çıkarma yoluyla ötenazi. Beyin rezeksiyon tarafından brüt diseksiyon sıçan beyin kaldırın. Yüzükoyun kafasından başlayın. Makas kullanarak, burun boyun arkasından cilde rostrally kesti ve kafatası maruz. Kaldırmak yumuşak doku kafatası yüzeyinden künt bir sonda ile. Kaudal ucundan çalışma, oksipital, Paryetal ve frontal kemik rongeurs kullanarak kafatasının kaldırmak. Dura uzunlamasına çatlak mikro makasla kesip geri her iki hemisferlerin katmandan peeling geri çek. Beyin kafatasından sırtüstü yere kafa dönme ve kranial sinirler ventral tarafta kesilmesinin çıkarın. Dilim yalıtım beyin eğilimli konumuna döndürmek ve tüm dokularda enine fissür Kaudal ve Pilus rostral kaldırarak hipokampüs içeren Merkezi bölümü yalıtmak. Düz kenarlı jiletle enine uçak (Yani koronal dilim) boyunca iki kesim yapmak. Beyin yapıştırmayın ' s çoğu Kaudal uçak cyanoacrylate tutkal kullanarak vibratome kesme banyo ortasına. Buz gibi eklemek, carbogen bubbled aCSF vibratome kesme Bath ve iç naylon saklama donanım yer. 3-4 kullanılabilir dilim hazırlıklar Yarımküre (6-8 toplam) başına elde etmek için kesilmiş 300 mikron kalın dilim. Hipokampus veya bir Yarımküre kortikal bölümünden yalıtmak ve böylece microcoil içinde uygun dilim döşeme ' s 5 mm çap doku iyi. 4. Konumlama ve perfüzyon sistem birleştirme örnek dolgu mi hazırlık Kangalcrocoil ' s doku odası vibratome gelen oksijenli aCSF ile ' bir transfer pipet kullanarak s kesme banyo. Kesilmiş beyin örnek alın ve bölge ilgi konumlandırmak (örneğin. piramit hücre Katmanı) diseksiyon kapsamı kullanan microcoil üzerine. Eklemek doku saklama aygıtı (naylon yıkama için yapıştırılmış naylon mesh net) örnek konumunu görüntüleme deneyi boyunca korumak için. Not: hızlı bir şekilde yoğun ışığa maruz kalma en aza indirmek için yordam konumlandırma örneği üzerinden devam etmek. Bir aktarım pipet kullanarak gerektiğinde ek oksijenli aCSF sağlamak. Geçişli oxygenator, microcoil ve sonda tarihinde microcoil derleme ( şekil 3) bir tablo kelepçe güvenli ve geçişli oxygenator cihaz ekleyerek yapıştırmayın asetal destek peg bobin üstüne deliğe. Üzerinde microcoil perfüzyon odası yerleştirerek perfüzyon sistemi mühür ' s doku iyi ve birlikte bir minyatür kablo bağı kullanarak iki cinching. Döşeme Tel kesiciler kullanarak kablo bağı itibaren aşırı uzunluğu. Not: başarılı mühürleme üzerine perfusate çıkış hattı üzerinden çıkarken dikkat edilmelidir ve hiçbir sızıntı perfüzyon odası silikon mühür belirgin olmalıdır. Bu koşullar sonda derleme önce onaylamak için hata donanım Imaging’e ciddi hasara neden. ACSF-ebilmek var olmak seen atık göle damlama sonra microcoil ve oxygenator al ve görüntüleme sonda vücudun üst derleme eklemek. Gradyan yığını üzerinde derleme slayt ve degrade sonda üstüne koltuk. Göreli yerleştirme ve bobin uygun bağlantı ayrıntılı Fotoğraflar, oxygenator ve yoklama donanım bileşenleri ( şekil 4) sağlanır. 5. Bay resim koleksiyonu performans mıknatıs içine monte sonda delik ekleme yere yakın Spektrometre sonda vücut açılış mıknatıs dibinde delik. Perfüzyon hatlar mıknatıs üst kısmında açma geçişli arasında aşırı uzunluğu geri çek. Tüm kullanılabilir bolluk bolluk alınmıştır sonra da perfüzyon satırlarından, önceden sonda vücut içine mıknatıs aynı anda daha fazla bolluk delik tepesinden perfüzyon satırlarından kaldırılırken tabanda delik. Sonda dibinde iki sabitleme vidaları dolgu yığın karşılık gelen deliklere konu. Devam etmeden önce perfüzyon satırları değil sıkışmak veya atık göle aCSF çıkış onaylayarak sonda ekleme sırasında müstehcen denetleyin. Not: perfusate çıkış için perfüzyon hatları ve riskleri donanım görüntüleme Bay felaket zarar kalıcı hasara neden olur onaylamak için hatası. Yok perfusate geri dönüş hattı atık göle çıkma görülür halinde soruşturma vücut kaldırmak ve perfusate akışı reinsertion denemeden önce olduğunu onaylayın. Birleştirilmiş perfüzyon sistemi ve görüntüleme spektrometresi şematik bir düzen oldu daha önce açıklanan 8. Sonda vücut bağlanma giriş ve çıkış suyu hattı degrade chiller takın. İçin degrade chiller pompa açmak ve su sıcaklık ayarı (19 ° C) onaylayın. Hava hortumu hava soğutma ünitesi bir hortum kelepçesi kullanarak sonda vücut takın. Hava soğutma ünitesi için akış topuzu açmak " 1 " pozisyon. Isıl tel sondası vücuda takın. Eş eksenli kablonun radyo frekansı (RF) giriş/sonda vücudunda çıkış preamp eklemek ' s proton (H) kanal. Güç kablosu degrade amplifikatörler sonda vücuda takın. RF dolap, içinde güç B0 tazminat birimi, (x, y, z), tüm üç gradyan amplifikatörler ve ana birimini açmak Spektrometre hazırlama değişken sıcaklık ayar modülü Konsolu’nda kullanma amaçlanan geçişli sıcaklığı ayarlamak. (Empedans) maç ve sonda içinde değişken Kondansatörler ayarlayarak (frekans) RF devre ayarlamak. Bu sonda vücut temelini wands işleyerek gerçekleştirilir. Spektrometre geçerli ayarlarını ' manyetik alan homojenliği örnek en üst düzeye çıkarmak için s dolgu bobinleri. Başlamak resim koleksiyonu toplamak delik örneğinizi mıknatıs içinde uzaysal konumunu belirlemek için pilot görüntüler. Tipik parametreler için bir iki boyutlu degrade yankı gibidir (TR/TE 100/4 ms, ortalama = = 1, nabız açı = 30 o, zaman 6 sn, matris = 64 x 64, görüş alanı = 0,3 x 0,3 cm, çözünürlük = 47 x 47 mikron =). Varsa uygun tarama geometri ve doku konum onaylamak için Difüzyon ağırlıklı pilotları toplamak. Tipik parametreler için bir iki boyutlu Difüzyon ağırlıklı pilot tarama aşağıdaki gibidir (TR/TE = 2000/11,6 ms, zaman 4.3 min, Δ = 6 ms, δ = = 1 ms, ortalama = 1, b 1200 (1860 etkili) = s/mm 2, matris 64 x 64, görüş alanı = 0.2 x 0.2 cm = Çözünürlük = 31 mikron). Akut dilim hazırlık istikrar özelliklerini belirlemek için Difüzyon ağırlıklı zaman serisi toplamak. Tipik parametreleridir bir iki boyutlu Difüzyon ağırlıklı görüntüsü aşağıdaki gibi (TR/TE = 1,5 saat, Δ = 2000/11,6 ms, saat 6 ms, δ = = 1 ms, ortalama = 42, b 1200 = s/mm 2, matris 64 x 64, görüş alanı = 0.2 x 0.2 cm, çözünürlük = 31 mikron =). Not: belirli bir sistem kararlılık karakterize istihdam Bay kontrast (T1, T2, difüzyon, duyarlılık), gibi faktörlere bağlı olarak açıklanan protokolden fiziksel pertürbasyon okudu ve Bay sinyal değişikliği birim birim zamanda değişir kaynaklanan pertürbasyon dedi.

Representative Results

Perfusate hazırlık Başarılı istihdam geçişli oksijen aygıtının, gazlar içinde sağlanan carbogen mevcut % 100 doygunluk koşulları aCSF perfusate içinde ulaşacak. Bu sağlanan gaz oksijen konsantrasyonu değişen ve aCSF perfusate bir oksijen metre (şekil 1)8kullanarak perfüzyon odası içinde çözünmüş oksijen içeriğinde değişiklik ölçerek göstermiş olabilir. Sıcaklık sabit12kalır koşuluyla Henry’nin yasasına göre sıvı bir örnek ile denge içinde çözünmüş gaz miktarını doğrudan o gazın kısmi basınç orantılıdır. Bu bilgi ve hassas gaz Standartlar kullanılarak, açıklandığı gibi bir aCSF örnek içinde bulunan çözünmüş oksijen miktarı ölçmek mümkündür. Bu bilinen kompozisyon gazlar için maruz kalma aCSF doymuş Çözümleri (1 saat veya daha uzun süre doğrudan bubbled) kullanarak oksijen metre kalibre tarafından sağlanır: yüksek oksijen konsantrasyonu gibi carbogen (% 95’i O2) ve düşük oksijen ile başka bir ile bir gaz konsantrasyon azot (%0 O2) gibi. Daha sonra ölçümleri oksijen elektrot uç bir örnek batış tarafından alınabilir. Geçişli oxygenator düzgün çalıştığını doğrulama atık perfüzyon üzerinden de ölçülerek elde edilebilir. Yüzde çözünmüş oksijen oksijen metre tarafından ölçülen oksijen kaynağı gaz teslim yüzde konsantrasyonu eşleşmesi gerekir. Ölçülen değerler bu kaynağı gaz daha düşük ise bu doku dilim içinde metabolik yetmezlik yol açabilecek bir donanım hatası öneririz. Örnek görünüm ve davranış Perfüzyon gerekli metabolitleri tedarik ve uzak metabolik atıkların yakında taşımak için yeterli almak akut dilim hazırlıklar göreli istikrar hali ulaşır. Bu noktadan itibaren akut dilimleri için dış pertürbasyon tabi ve bu değişiklikleri yanıtlarını bilimsel çalışma için ölçülebilir. Bay deneyler için zaman içinde faiz sinyal izleme akut dilim hazırlıklar13göreli kararlılığını göstermek için yaygın olarak kullanılan bir uygulama olacaktır. Difüzyon ağırlıklı sinyal infarkt iskemik inme14,15dakika içinde algılamak için bu kontrast mekanizma kullanımı tarafından takdir gibi özellikle mendil’ın su hareketlilik, içerik ve dağıtım, değişiklikler duyarlıdır. Normalleştirilmiş Difüzyon sinyali zaman perfüzyon koşulları çeşitli altında tutulan akut kortikal dilimleri içinde komplo gösterir nispeten istikrar (2 ± %3 15,5 s) sonra doku izolasyon sağlanır (şekil 5). Difüzyon sinyali istikrar muhafaza perfüzyon koşulları (aralıklı ya da sürekli) veya MRI tarama uzunluğu ne olursa olsun (kısa [4 dk] veya uzun [1,5 saat])8. Bu suboptimal deneysel koşullar düşündüren ise dilimleri perfüzyon, almayan yaşam korteks gözlenen keskin Difüzyon sinyali artış gibi zaman içinde sinyal kararlılık gösteren değil. Pertürbasyon deneyler istikrarlı sinyal koşulları dilim müstahzarları onayı öncesinde denenmesi gerektiğini değil. Sinyal istikrar ek olarak, doğru örnek konumlandırma görüntü toplanması sırasında teyit edilmelidir. Örnek pozisyon diseksiyon mikroskop, doku yerleştirme sırasında kontrol edilir olsa da, örnek pozisyon nöbetleşe perfüzyon aygıtının ya bobin veya sonda mıknatıs içine ekleme önce kaba işleme nedeniyle derleme sırasında ortaya çıkabilir. Onay uygun Hipokampal yerleşimi elde kısa toplayarak (2 dk), pilot inceden inceye gözden geçirmek ile Difüzyon kontrast (şekil 6). Piramit hücre katmanı bitişik Hipokampal lamina Difüzyon ağırlık için daha duyarlı olduğundan, bu yapının Difüzyon ağırlıklı görüntülerde daha koyu bir grup olarak görünür. Bu karakteristik özelliği görüntülemez kurulumları Merkezi kapalı örnekleri içeren ve büyük olasılıkla tekrar edilmesi gerekir. Resim 1: aCSF perfusate oksijen içeriği yüzde O2 içeriği sağlanan gaz bir fonksiyonu olarak feshetti. Carbogen karışımları oksijen (% 95, % 60 ve % 19) değişken konsantrasyonları içeren bir tedarik gazı istihdam edilmektedir. Yüzde çözünmüş oksijen okuma sonra perfüzyon güzellikle ve iki bilinen kontrollere göre: bir perfusate rezervuar doğrudan carbogen (% 95’i O2) ve atmosferik koşullar ( O2 maruz perfusate su deposu ile bubbled. ). Her durumda, doku perfüzyon yaklaşımlar içinde kullanılan carbogen karışımı O2 konsantrasyonunun % 100 yüzde oksijen doygunluğu sitesinde. Hata çubukları için standart sapma örnek anlamına gelir eşittir. Şekil orijinal madde8izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: şematik geçişli oxygenator ve perfüzyon TMMOB çizim. Bu diyagram uygulama projesi öğeleri bu kritik cihazların işlevi sorumlu gösterilmiştir. Bir kabarcık tuzak pompalanır taze perfusate oxygenator üstündeki bir 10 mm NMR tüp yoluyla girer. Bunu yaparken, bir çok gaz haline geçiş içinde iç içe geçmiş bir açık uçlu, 5 mm NMR tüp dolanmak geçirgen silikon tüp (mavi kesim). 5 mm tüp üst yoluyla sağlanan Carbogen gaz açık uçlu alt ile odaya girer ve oxygenator 10 mm tüp cap havalandırma deliğinden çıkmadan önce sarmal silikon tüp üzerinde geçirir. Bu pozlama sırasında silikon tüp geçerek akan perfusate sağlanan gaz karışımı kimyasal bileşenleri ile doymuş hale gelir. Oxygenator çıktıktan sonra perfusate bir atık toplama haznesi için önde gelen geri dönüş hattı girmeden önce doğrudan perfüzyon odasına geçer. Diğer bileşenler bu tasarım için kritik dikey olarak değiştirilmiş RF microcoil, oxygenator’ın perfüzyon odası arasında sıvı geçirmez mühür oluşturan bir silikon çamaşır makinesi (kırmızı halka) üstünde durmaya oxygenator sağlayan asetal destek peg içerir ve tersine çevrilebilir mühürü oluşturmak için kullanılan bir kablo bağı yerleşimini barındıran microcoil’ın doku iyi ve kablo bağı çentik. Bu şekil değiştiren ve özgün makale8izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: her arabirim için geçişli oxygenator izin microcoil derleme değişiklik. İki yiv 3.0 x 1.5 mm (siyah oklar) perfüzyon odası imzalamak için kullanılan bir kablo bağı genişliğini karşılamak derleme yan içine kesilmiş. Bir kanal (15 x 3 x 4 mm) bahçeleri bobin arka yüzüne bağlanır. İki naylon boşluk olarak mühürleme işlemi kolaylaştırır kablo kravat kafa için bir catch kanal (Kırmızı oklar) Yasası’nın taraf yerleştirilir. Bobin derleme (sarı arr üst delinmiş bir delik (2 mm x 14 mm)ow) birleştirmeler için asetal peg oxygenator güvenliğini sağlamak için destek. Bu şekil değiştiren ve özgün makale8izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: fotoğraf ayrıntılı göreli yerleştirme ve microcoil, oxygenator ve sonda bileşenleri uygun montaj montaj. Bu görüntüler anahtar donanım bileşenleri geçişli oxygenator ve microperfusion cihazın özelliği ve nasıl ayrı parçalar ile başka bir arabirim göstermektedir. (A) tüm bileşenleri de doku mühürleme veya derleme sonda vücudun önce göreli yerleşimini gösteren şemayı göster fotoğraf. Doğru parçaları göreli konumunu görüntülemek için mevcudiyetlerinin; Böylece tüm bileşenleri resim çerçevesi içinde uygun ancak, perfüzyon satırları bir bölümünü geri bu seride ikiye katlandı. (1 = sonda kafa, 2 microcoil derleme, 3 = naylon doku saklama yüzük, 4 =, perfüzyon = 5 kablo bağı, 6 = geçişli oxygenator, 7 = degrade bobinleri, 8 = kabarcık tuzak =). (B) bobin ve oxygenator derleme aşağıdaki bileşenleri. Bu görüntüde, naylon saklama halka içinde microcoil’ın doku iyi bir örnek güvenliğini sağlamak için yerleştirildi. Asetal destek peg oxygenator üsteki microcoil üstüne karşılık gelen deliğe güvenli olmuştur. Silikon conta perfüzyon açık ucunda iyi doku iyi yerleştirilmiş ve kablo bağı perfüzyon odası mühürlemek için bu bileşenlerin pekiştirdi. Son olarak, microcoil Bankası sonda başının üst bağlı olmuştur. (C) prob derleme aşağıdaki bileşenleri. Son panelinde kablo bağı itibaren aşırı uzunluğu floş microcoil ile kesilmiş. Degrade bobin yığını sonra dikkatle silindir sonda doğru ilerleyen aşırı perfüzyon çizgiler, oxygenator ve microcoil onun içi boş merkezinden geçen süre pozisyon içine kaydırdı. Degradeler sonda başından bağlandıktan sonra onlar sabitleme yaka sondası degradeler dişli tabanı üzerinde vidalama ile yerde düzenlenen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5: difüzyon sinyali superfused akut kortikal dilimleri istikrardır. (A) NORMALIZED Difüzyon sinyali değerleri için farklı superfusion paradigmalar tabi dört akut dilimleri içinde 21,5 saat ötenazi takip bir süre için zaman içinde çizilir. Dilimleri kalır ± %5 15,5 ötenazi ne olursa olsun, superfusion olup olmadığını takip h bir süre için onların ilk Difüzyon sinyali ölçü içinde sürekli ya da aralıklı ve Bay tarama uzunluğu (1,5 saat veya 4 dk) bağımsızdır. Formaldehit sabit korteks alınan sinyal kayıtları hizmet olumlu denetim (n = 1) sabit doku örnekleri statik, değişmeyen yapısı nedeniyle istikrar için. Diğer taraftan, difüzyon sinyali ölçülen içinde canlı bir dilim superfusion destek (n = 1) metabolik eksikliği için bir denetim olarak hizmet vermektedir. Farklı superfusion denemelerin deneme parametreleri aşağıdaki gibidir: sürekli (her zaman açık, inceden inceye gözden geçirmek her zaman superfusion 1,5 saat =), aralıklı (10 dk Aralık taramaları arasında superfusion zaman oranı 1,5 saat =), uzun aralığı, uzun inceden inceye gözden geçirmek (superfusion üzerinde Ama durduruldu arasında inceden inceye gözden geçirmek, 10 min için tarama sırasında tarama zaman 1,5 saat =), uzun aralığı, kısa tarama (inceden inceye gözden geçirmek, arasındaki 1,5 saat aralığı için superfusion zaman oranı 4 dk =). (B) analiz verileri gösteren grup dört canlı dilimli superfusion deneyler panelinden (A) anlamına gelir. Difüzyon sinyali profil gruplandırılmış superfused kortikal dilimleri sergiler (2 ± %3 15,5 h üzerinden) zamanla küçük varyasyon ise sigara periosteum denetim (n = 1) dramatik sinyal istikrarsızlık erken (6.5 h. tarafından % 15) deneme sergiler. Bu şekil değiştiren ve özgün makale8izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6: pilot görüntüleme sırasında Hipokampal dilim yerleştirme onay. Genişletilmiş bir Bay mikroskobu oturumu çalıştırmadan önce doğru örnek yerleşim inceden inceye gözden geçirmek zaman gibi kaynakları sağlamak için kritik ve pahalı olduğunu perfusate katkı maddeleri boşa değildir. Hipokampüs, CA1 bölgesindeki piramit hücre katmanı daha hızlı (4.3 min) görüntülenir, çözünürlük (31 mikron x 31 mikron içinde-uçak) pilot taramaları faiz dokusunun doğru mikro-bobin ile ilgili olarak yerleştirilir emin olmak için alt. Tarama parametreleri her iki resimlere ortak şunlardır: TR/TE 2000/11,6 ms, Δ = 6 ms, δ = 1 = ms, ortalama = 1. (A) b = 0 (227 etkili) s/mm2. Bu ön tarama, stratum pyramidale daha yeni bir gri, çapraz grup KANGAL’ın uyarma profil içinde ortalanmış olarak görünür. (B) b 1200 (1,860 etkili) = s/mm2. Piramit hücre katmanı bitişik lamina dokularda daha koyu hale gelir daha yüksek Difüzyon ağırlığı, interlamellar karşıtlığı artırır (yukarıda: tabaka oriens; aşağıda: stratum radiatum). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Geçerli protokol akut beyin dilim hazırlıklar manyetik rezonans mikroskobu geçiren standart metabolik bakımı için gerekli yordamlar açıklanır. Bu yordamı çözünürlüklerde Bay ile yaşayan memeli dokuların görselleştirme hücreleri çözme yeteneğine sağlayan tek yöntem mevcut olduğunu. Açıklanan perfusate koşulları özellikle merkezi sinir sistemi dokuların uyarlanır, protokol yaygın olarak yaşam herhangi bir şekilde uyarlanabilir iken doku hazırlanması ayarlamalar sayesinde perfusate ve gaz bileşenlerinin yanı sıra perfüzyon akış hızı ve sıcaklık.

En sık görülen sorunlar açıklanan işlemler sırasında karşılaşılan olası hataları metaboliti tedarik ile ilgili içerir. Kalsiyum tuzları yağış aCSF içinde sistem tampon bikarbonat hataları sonucunda gaz halinde olan yakıtlar yetmezlik sırasında oluşabilir. Böyle precipitates perfüzyon satırları yapışmasına neden olabilir ve ciddi donanım zarar görmesine neden. Eğer tuz precipitates sonda derleme takip perfusate gözlenir, Peristaltik pompa kapatmak çevirerek perfüzyon akışı derhal sona. Tedarik gaz ve carbogen gaz akışı (1/16 L/dak) rezervuar ve oxygenator yeterli sodyum bikarbonat düzeyleri (4,37 g/2 L) perfusate, CO2 düzeyleri (% 5.0) varlığını doğrulamak. Son olarak, pH seviyeleri fizyolojik aralığında (7,3-7,4) bağları onaylayın. Oksijen gaz ve pH düzeyleri uygun şekilde hala düzenlenir değil olay nedeniyle gaz değişimi membran değiştirilmesi gerekir.

Dilimleri amaçlanan deneysel zaman-boyunca sinyal istikrar sergi değil, doğru kimyasal bileşenlerin aCSF karışımı bulunduğundan ve doğru osmolalite (300 mOsm) ve pH (7,3-7,4) korunur doğrulayın. Ayrıca, carbogen gaz perfusate rezervuar ve 1/16 L/dk oxygenator için sağlanan emin olun. Aşağıdaki adımları perfusate koşulları düzeltmezseniz, gaz değişimi membran değiştirilmesi tavsiye edilir. Doku istikrar perfusate koşulları sorun giderme sonra elde değil, doku hasat ve perfüzyon uygulama arasındaki zaman aralığını en aza indirerek üzerinde bir odak cerrahi protokolüyle arıtma düşünün.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01) gelen hibe tarafından desteklenmiştir (S10RR031637) ve Ulusal Bilim Vakfı (işbirliği anlaşması No DMR-1157490) aracılığıyla UF ve Florida eyaletinde Ulusal yüksek manyetik alan Laboratuarı (NHMFL) gelişmiş manyetik rezonans görüntüleme ve spektroskopi (AMRIS) tesisinde.

Materials

Perfusate Preparation
Osmette A Precision Systems Inc. 5002 freezing point depression osmometer
Stir Plate Type 1000 Barnstead/Thermodyne SPA1025B magnetic stir plate with heating element
Accumet Basic pH Meter Fisher Scientific AB15 pH Meter
pH Probe Fisher Scientific 13-620-AP61 probe for pH measurement
Oxygen Meter Microelectrodes Inc. OM-4 meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates
Oxygen Electrode Microelectrodes Inc. MI-730 microprobe for the oxygen meter
Scale Denver Instrument Co. A-160 microscale for weighing chemical components
Name Company Catalog Number Comments
Slice Preparation
Lancer Vibratome Ted Pella Inc. Series 1000 vibratory tissue slicer
Disecting Microscope Carl Zeiss Inc. OPMI 1-FC tabletop, binocular disecting microscope
Name Company Catalog Number Comments
Perfusion System
Masterflex L/S Cole-Parmer 7523-50 peristaltic micro perfusion pump
Oxygen Regulators x 2 Victor Medical VMG-05LY device for regulating gas flow
e-sized carbogen cylinders x 2 Airgas gas tanks containing carbogen gas
in-bore oxygenator developed in house device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate
Name Company Catalog Number Comments
MR Imaging Hardware
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) Bruker Biospin B6371/0001 four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil
Micro 5 probe body Bruker Biospin Z3395 microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer
Micro 5 gradient coils Bruker Biospin M81111 gradient coil stack used with micro 5 probe body
600 MHz Spectrometer Oxford Instruments superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation
Imaging Console Bruker Biospin Avance III support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation
Air Blower Bruker Biospin BCU-II, -80/60 Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore
Gradient Chiller Thermo Scientific Neslab Merlin M33 Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
  2. Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons. J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).
  3. Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons. Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).
  4. Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes. Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).
  5. Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation. Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).
  6. Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue. Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).
  7. Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -. A., Popovic, R. S. High-Q factor RF planar microcoils for micro-scale NMR spectroscopy. Sensor. Actuat. A-Phys. 97, 280-288 (2002).
  8. Flint, J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. A microperfusion and in-bore oxygenator system designed for magnetic resonance microscopy studies on living tissue explants. Sci. Rep. 5, 18095 (2015).
  9. Khong, Y. M., et al. Novel intra-tissue perfusion system for culturing thick liver tissue. Tissue Eng. 13 (9), 2345-2356 (2007).
  10. Schumacher, K., Khong, Y. -. M., Chang, S., Ni, J., Sun, W., Yu, H. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
  11. Shepherd, T. M., Blackband, S. J., Wirth, E. D. Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices. Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).
  12. Henry, W. Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).
  13. Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J., Blümler, P., Blümich, B., Botto, R., Fukushima, E. Studies of perfused brain slices with MR microscopy. Spatially Resolved Magnetic Resonance. , 337-343 (1998).
  14. Moseley, M. E., et al. Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy. Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).
  15. Moseley, M. E., et al. Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats. Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).

Tags

Magnetic Resonance MicroscopyMetabolic SupportArtificial Cerebrospinal FluidCarbogenOxygenatorPeristaltic PumpFlow RateBubble Trap

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition. J. Vis. Exp. (128), e56282, doi:10.3791/56282 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image