دعم الأيضية اقتطعت، أنسجة المخ الحية أثناء الرنين المغناطيسي المجهري اقتناء
Summary
البروتوكول الحالي وصف أسلوب التي المستخدمين يمكن الحفاظ على استمرارية الأعمال التحضيرية شريحة هيبوكامبال والقشرية الحاد أثناء جمع البيانات الرنين المغناطيسي المجهري.
Abstract
ويصف هذا البروتوكول الإجراءات الضرورية لدعم الوظائف الأيضية الطبيعية للدماغ الحادة شريحة الأعمال التحضيرية أثناء جمع البيانات مجهرية الرنين المغناطيسي (السيد). في حين أنه من الممكن لأداء مجموعات السيد في أنسجة الثدييات الحية، وقصت، هذه التجارب وقيدت تقليديا بحدود القرار وهي بالتالي عاجزة عن تصور الأنسجة المجهرية. على العكس من ذلك، السيد البروتوكولات التي تحقق دقة الصورة المجهرية تقتضي استخدام عينات الثابتة تلبية الحاجة لشروط ثابتة، لا تتغير خلال أوقات طويلة المسح الضوئي. البروتوكول الحالي يصف الأسلوب الأول السيد المتاحة التي تمكن من تصوير عينات الأنسجة الحية، والثدييات في قرارات مجهرية. هذه البيانات ذات أهمية كبيرة لفهم كيف المستندة إلى علم الأمراض التباين التغيرات التي تحدث في تأثير المستوى المجهري محتوى العيانية السيد المسح مثل تلك المستخدمة في العيادة. ويتحقق مرة واحدة مثل هذا فهم، أساليب التشخيص بحساسية ودقة أكبر يمكن تطويرها، التي سوف تترجم مباشرة إلى علاج الأمراض السابقة ورصد العلاج أكثر دقة وتحسين نتائج المرضى.
بينما وصف المنهجية تركز على الاستعدادات شريحة الدماغ، البروتوكول قابلة للتكيف لأي شريحة الأنسجة قصت نظراً إلى أن يتم إجراء تغييرات في الإعداد بيرفوساتي والغاز لتلبية احتياجات ايضية محددة في الأنسجة. ينبغي أن يؤدي التنفيذ الناجح للبروتوكول الأعمال التحضيرية شريحة العيش، الحاد الذي يحمل السيد نشر إشارة الاستقرار لفترات تصل إلى 15.5 ح. المزايا الأساسية للنظام الحالي على أجهزة التروية متوافق مع السيد الأخرى هي توافقه مع أجهزة الفحص المجهري MR اللازمة لبلوغ أعلى الصور ذات الدقة والقدرة على توفير تدفق مستمر ودون انقطاع مع بعناية شروط بيرفوساتي الخاضعة للتنظيم. عينة انخفاض الإنتاجية نظر مع هذا التصميم كما قد تصويرها شريحة نسيج واحد فقط في كل مرة.
Introduction
كما نظم التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) تقدمت باطراد إلى مواطن القوة الميدانية أعلى من أي وقت مضى، أصبحت ملحوظة مزيد من التفاصيل حول تكوين وحالة الأنسجة الحية. وعلى الرغم من أوجه التقدم هذه الأجهزة، لا تزال غير متوفرة في العيادة MR التصوير بدقة كافية لتصور الهياكل الخلوية للأنسجة. كنتيجة لذلك، يجب أن يمكن استنتاج خصائص المستوى الخلوي للأنسجة عند النظر في مضمون عمليات الفحص السريري. يتطلب مثل هذا الاستدلال معرفة عمليات المماثلة التي استقاها من البيانات المأخوذة في النظم النموذجية التي يمكن ملاحظتها مباشرة. تقليديا، شملت هذه النماذج الخلايا من الكائنات المائية مثل البويضيه ليفيس النمو و كاليفورنية Aplysia L7 العصبية1،2. كانت هذه من بين الخلايا الحيوانية الأولى المتاحة للمراقبة مع أساليب السيد بسبب حجمها الكبير يظهر: حوالي 1000 ميكرومتر و 300 ميكرومتر القطر، على التوالي. في الآونة الأخيرة، قد أتاح التقدم في تصميم الأجهزة لواحد من أكبر الأمثلة على خلايا الثدييات – α-العصبون – تصويرها باستخدام تقنيات الفحص المجهري السيد على الأنسجة الثابتة3،4. في حين أظهرت هذه الدراسات التصور المباشر للمواد الخلوية الثدييات استخدام السيد، عينات الثابتة المستخدمة تختلف إلى حد كبير في خصائصها السيد من الأنسجة الحية ولا يمكن أن تكون بمثابة وبالتالي نموذج تمثيلي يعادل5، 6. الأهم من ذلك، مراقبة السيد التباين التغيرات التي تحدث في الحفل مع العمليات البيولوجية المعقدة يتطلب العينات الحية التي يمكن قلق وقياس مدى التجربة التصوير.
تيسير السيد دراسات مجهرية في الأنسجة الحية، يرد بروتوكول الذي يشمل ميكرويماجينج التجارية الأجهزة7 ربطه بنيت لهذا الغرض، والسيد مكساج متوافقة، في تحمل ونضح الجهاز السابق وصف8 . وتشمل مزايا فريدة من نوعها لهذا التصميم قدرات حل المستوى الخلوي في أنسجة الثدييات والدقة في السيطرة على محتوى الغاز المذاب، ودرجة الحموضة في موقع نضح الأنسجة. أيضا، على عكس غالبية الدراسات السيد اكسبلانت الذي يقطع التروية أثناء الحصول على الصور لتجنب تدفق المصنوعات اليدوية، هذا التصميم يدعم استخدام التروية المستمرة أثناء جمع البيانات التي تبين أن تحسين الحالة الفسيولوجية عزل الأنسجة9،10. وأخيراً، مطولة تسجيل مغلق الدائرة والاحتفاظ بشريحة المعونة الأجهزة في الحد من احتمال التحف الحركة التي يمكن أن تحدث إلا من خلال مجموعة الصور.
بينما البروتوكول الحالي يصف الإجراءات المناسبة للاستخدام مع شرائح هيبوكامبال والقشرية الحادة، يتيح مراقبة دقيقة على نواتج الأيض بيرفوساتي هذا النظام لاستيعاب مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة المتنوعة والظروف التجريبية. وتشمل القيود المفروضة على هذا التصميم انخفاض الإنتاجية عينة مقارنة بشريحة متعددة نضح دائرة11؛ ومع ذلك، يمكن التغلب هذا القيد في المستقبل باستخدام صفائف لفائف متعددة.
أيضا، في حين يمكن أن تستخدم النظام المبين في تكوينات سواء أفقياً أو رأسياً، يتميز البروتوكول الحالي استخدامها في مطياف 600 ميغاهرتز ذات اتجاه أفقي،. أي نظام قادر على الدراسات ميكرويماجينج السيد – عادة ما تحمل الضيق (دي سيكس سم)، المطيافات ارتفاع الحقل (إيه فايف زيرو زيرو ميجاهرتز) – سوف تستوعب معدات مكساج ونضح ووصف. بيد التغييرات اللولب التصوير، والتدرج، ونظام التحقيق أو أخرى أجهزة التصوير الأساسية المستخدمة قد تستلزم إجراء تعديلات على معدات نضح والسيد المسح معلمات.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف البروتوكول الحالي بالإجراءات اللازمة لصيانة الأيضية القياسية الاستعدادات شريحة الدماغ الحادة تمر بالرنين المغناطيسي المجهري. هذا الإجراء هو الطريقة الوحيدة المتاحة حاليا أن يسمح تصور أنسجة الثدييات العيش مع السيد في قرارات قادرة على حل الخلايا. بينما بيرفوساتي الشروط الموصوفة مصممة خصيصا لانسجة الجهاز العصبي المركزي، البروتوكول قابل للتكيف على نطاق واسع إلى أي أسلوب معيشة إعداد الأنسجة من خلال تعديلات مكونات بيرفوساتي والغاز، فضلا عن معدل تدفق التروية ودرجة الحرارة.
أكثر المشاكل شيوعاً التي يرجح أن تواجهها أثناء الإجراءات الموصوفة تشمل تلك المتعلقة بالفشل في إمداد المستقلب. يمكن أن يحدث ترسيب لأملاح الكالسيوم داخل قام أثناء عدم كفاية الغازية نتيجة للفشل في بيكربونات التخزين المؤقت للنظام. هذه رواسب يمكن أن تسد خطوط نضح ويؤدي إلى تلف الجهاز الشديدة. إذا لوحظت رواسب الملح في بيرفوساتي عقب التحقيق الجمعية، وقف تدفق نضح على الفور بإيقاف مضخة تمعجية. تأكيد وجود مستويات كافية من بيكربونات الصوديوم (غ 4.37/2 لتر) في بيرفوساتي، مستويات2 CO (5.0 في المائة) في إمدادات الغاز، وتدفق الغاز كاربوجين (1/16 لتر في الدقيقة) إلى الخزان ومكساج. وأخيراً، تأكيد استقرت مستويات الحموضة في نطاق الفسيولوجية (7.3-7.4). في حال أن مستويات الأكسجين في الحموضة والغاز لا تزال تنظم لا على نحو ملائم، ينبغي الاستعاضة عن غشاء تبادل الغازات.
إذا كانت الشرائح لا يحمل إشارة الاستقرار على مدى المقصود التجريبية الوقت-، تأكيد أن المكونات الكيميائية الصحيحة موجودة في الخليط قام والإبقاء على أوسمولاليتي الصحيح (300 موسم) والأس الهيدروجيني (7.3-7.4). أيضا، تأكد من هو تزويد الغاز كاربوجين إلى خزان بيرفوساتي ومكساج في 1/16 لتر في الدقيقة. إذا كانت هذه الخطوات لا تصحح الأوضاع بيرفوساتي، ينصح باستبدال غشاء تبادل الغازات. وإذا لم يتحقق الاستقرار الأنسجة بعد استكشاف الأخطاء وإصلاحها في ظروف بيرفوساتي، النظر في تنقيح البروتوكول الجراحي مع تركيز على تقليل الفاصل الزمني بين التطبيق الحصاد ونضح الأنسجة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من “المعاهد الوطنية للصحة” (1R21NS094061-01A1) (المعاهد الوطنية للصحة 1R01EB012874-01) (S10RR031637)، و “المؤسسة الوطنية للعلوم” (اتفاق تعاوني رقم DMR-1157490) من خلال مرفق مختبر المجال المغناطيسي عالية الوطنية (نهمفل) “متقدمة التصوير بالرنين المغناطيسي” و “التحليل الطيفي” (أمريس) في الجبهة المتحدة وولاية فلوريدا.
Materials
| Perfusate Preparation | |||
| Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
| Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
| Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
| pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
| Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
| Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
| Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Preparation | |||
| Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
| Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion System | |||
| Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
| Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
| e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
| in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MR Imaging Hardware | |||
| Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
| Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
| Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
| 600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
| Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
| Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
| Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |
References
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons. J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons. Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes. Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).
- Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation. Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).
- Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue. Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).
- Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -. A., Popovic, R. S. High-Q factor RF planar microcoils for micro-scale NMR spectroscopy. Sensor. Actuat. A-Phys. 97, 280-288 (2002).
- Flint, J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. A microperfusion and in-bore oxygenator system designed for magnetic resonance microscopy studies on living tissue explants. Sci. Rep. 5, 18095 (2015).
- Khong, Y. M., et al. Novel intra-tissue perfusion system for culturing thick liver tissue. Tissue Eng. 13 (9), 2345-2356 (2007).
- Schumacher, K., Khong, Y. -. M., Chang, S., Ni, J., Sun, W., Yu, H. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
- Shepherd, T. M., Blackband, S. J., Wirth, E. D. Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices. Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).
- Henry, W. Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).
- Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J., Blümler, P., Blümich, B., Botto, R., Fukushima, E. Studies of perfused brain slices with MR microscopy. Spatially Resolved Magnetic Resonance. , 337-343 (1998).
- Moseley, M. E., et al. Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy. Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).
- Moseley, M. E., et al. Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats. Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).
