代謝サポートの切除、生体脳磁気共鳴顕微鏡集録時に

記述されているすべての動物実験科学国立アカデミーのガイドラインに従ってください ' ケアおよび実験動物の使用のためのガイド とレビューされ、フロリダ大学によって承認された ' s制度上のアニマル ・ ケアおよび使用委員会 (IACUC)。すべての適用可能な規則および規制に従う動物の対象研究に従事するとき。 1 です中枢神経組織の維持のための準備の出納 作る新鮮な人工髄液 (アプライド)。。 アプライドの重炭酸塩緩衝液 2 リットルを生成、1,500 mL の 4 L フラスコに二重蒸留または逆浸透膜で精製した水を測定します。フラスコ内電磁攪拌棒を置き、撹拌プレートを使用して液体をかき混ぜなさい。 精製水に溶解塩の次の量: 14.03 g (120 mM) 塩化ナトリウム、4.37 g (26 mM) 重炭酸ナトリウム、リン酸一カリウム 0.41 g (1.5 mM)、0.69 g (1.4 mM) 硫酸マグネシウム七水和物、0.59 g (2 mM) カルシウム塩化物の二水化物、塩化カリウム 0.45 g (3 mM)、および 3.6 g (10 mM) ブドウ糖 。 メモ: 液の化学の内容は、組織、実験の希望条件の特定の代謝の要件に応じて異なります。 では、このソリューションを徹底的にミックスすべて塩が溶解するまで。2 l その他の精製水を使用して音量を調整します。 は、凍結ポイント不況 osmometer を使用してアプライドの浸透圧をテストします。調整 300 mOsm/kg ソルビトールを使用します。299 mOsm/kg アプライド出納の 2 リットルに 324 mg ソルビトール添加が 300 mOsm/kg (324 mg 当たり約 1 mOsm) 浸透圧を増加します 。 注意: アプライドが 4 ° c 24 時間を超えない期間の密閉、密閉瓶で保存することができます 2。灌流システムの設定 アプライド出納を準備します。 Equilibrate アプライド周囲温度 (~ 23 ° C) 未満 1 h. の直接バブリングを介してカーボゲン ・ 95% (95% O 2, 5% CO 2; 1/16 L/min) を毒ガス攻撃中に 注: 異なる組織の種類または目的の実験条件は、液の温度やガスの内容の調整を必要があります。液溶存ガスの含有量の望ましい条件を供給ガス ( 図 1) の個々 のコンポーネントのパーセントの濃度を変化させることにより正確にコントロールできる。 、アプライド カーボゲン ・彩度、必要な温度に達すると pH は、生理学的な範囲 (7.3 7.4) を確認します。適切な溶存酸素濃度と健康な組織代謝に資する pH 条件を維持するために実験の過程で出納貯水池 (1/16 L/分) に直接泡ガスし続ける。 灌流線をプライムします。 (300 mOsm, pH 7.3 7.4, 継続的に毒ガス) 準備のアプライドに蠕動マイクロ ポンプに接続されている入口管埋没。 磁石を退屈させる パス、人工デバイス ( 図 2) と両方を通る血流線と傾斜磁場コイル (上下から) をスタックし、プローブ組立まで脇コイルします。アプライド排水をキャッチするビーカーの上肺をハングします 。 注: MRI システムの設計によって灌流線はアプライドでシステムをプライミングする前に基本プローブ本体のグラジェント ・ コイルや磁石の穴を通して渡される必要があります。プローブ本体のプライミングの手順を開始する前に穴にプローブの挿入アセンブリでその潅流線配置に干渉しないことを確認します。 目的の流量 (2 mL/分) が選択されていることを確認し、ポンプに切り替えることにより灌流行の入力を開始します。 アプライドが中含まれている空気を転置するように、空行でバブル トラップを反転します。 接続、人工 ' s ガス カーボゲン ・ (マニホールドまたはセカンダリ カーボゲン ・ シリンダー) の 2 番目のソース ポートと 1/16 L/分の流量を設定 そのカーボゲン ・は、肺を流れることを確認 ' s ガス交換膜、肺の上に排気口を水に浸漬します。 灌流チャンバーから滴り落ちるアプライドが検出されると、手動攪拌による流入ラインからの任意の目に見える気泡を削除します。 灌流チャンバーから流れるアプライドの酸素電極の沈没によって、肺が正常に動作ことを確認します 。 注: 酸素計の読みに近いガスに含まれる酸素の割合。 3。ティッシュの準備 安楽死 場所の 4 分の 1 L/分の速度でガスの麻酔器、酸素運搬で 4% イソフルランに公開の誘導室にラット (125-150 g) 麻酔室から無意識のラットを削除します。 は、仰臥位でラットを配置することによって立ち直り反射テストを実行します。あらゆる動きをチェック — 頭の回転、脚上げ、脊柱屈曲等 — 動物は胃袋に回して直説法。 は、綿棒を使用して動物の開いた目に触れることにより瞬目再帰テストを実行します。任意の応答をチェック — 蓋の閉鎖、筋肉がぴくぴく、等 — この感覚入力する。 最後に、を実行、手足は、ラットの足の指の間の皮膚をつまんで、反射テストを撤回 ' s 伸ばした後ろ足ピンセットや止血剤を使用します。脚の屈曲を確認 注: 場合正再帰テスト結果、安楽死を 続行しないでください します。 反応を引き出す 3 つの反射テストのいずれかの場合に、ラットを麻酔室にすぐに戻るし、4% イソフルラン暴露のさらに 2 分間許可します。 は、完全に上すべての 3 つの再帰テストを実行します。必要に応じて 2 分麻酔の露出を繰り返し、すべての 3 つの再帰テストの応答の完全な欠如を観察されている一度にのみ続行します。 ギロチン斬首を介してラットを安楽死させる。 脳切除 総郭清によるラット脳を削除します。腹臥位で頭を開始します。はさみを使用して、吻方鼻に、首の後ろから皮膚を切って、頭蓋骨を公開します。 鈍プローブと頭蓋骨の表面から軟部組織を削除します。 後頭, 頭頂部, と rongeurs を用いた頭蓋の頭骨尾側から動作している、削除します。 マイクロはさみで縦裂に沿って切ると戻る両半球から層を剥離によって硬膜をリトラクトします。 頭蓋骨から仰臥位に頭を回すと腹側脳神経を切断して脳を削除します。 スライス分離 脳を腹臥位に戻り、横の割れ目に尾と、采に吻側すべてのティッシュの取り外しによって海馬を含む中央部を分離します。ストレート エッジかみそりで横断面 (すなわち コロナ スライス) に沿って 2 つのカットを作る。 脳を貼る ' シアノアクリ レート系接着剤を使用して vibratome 切削風呂の中央に s 尾ほとんど平面です。 冷たい追加、カーボゲン ・ vibratome 切削風呂にアプライド、内側ナイロン保持ハードウェアを配置します。 半球 (6 に 8 の合計) あたり 3 に 4 使用可能なスライスを取得するカット 300 μ m の厚さのスライスします。 海馬や大脳皮質のセクション 1 つの半球から分離し、病巣内に収まるようにスライスをトリム ' s 5 mm 径組織も。 4。サンプル位置決めと灌流システム アセンブリ 塗りつぶし、mi を 調製をコイル のcrocoil '、vibratome から酸素アプライドの組織室 ' 転送ピペットを使用して s 切削風呂。 トリム脳サンプルを取るし、関心領域の位置 (例えば錐体細胞層) 切り裂くスコープを使用して病巣を。。 挿入組織保持デバイス (ナイロン メッシュ ネット ナイロン洗濯機に貼付) イメージング実験を通してサンプル位置を保持する 。 注: は、強いライトへの露出を最小限に抑える手順を位置決めサンプルをすぐに続行します。必要に応じて転送ピペットを使用して、追加の酸素アプライドを提供します。 穴で肺栓塞、プローブを組み立てる テーブル留め具で変更された病巣アセンブリ ( 図 3) をセキュリティで保護し、挿入して穴に人工デバイスを貼る、コイルの上に穴にアセタール サポート ペグ。 、病巣を灌流チェンバを配置することによって灌流システムをシール ' s 組織と一緒にミニチュアのケーブルタイを使用して 2 つの cinching です。 がワイヤー カッターを使用してケーブル ネクタイから余分な長さをトリムします 。 注: 成功のシールに出納されるべき流出の行を終了して漏れがありません灌流チェンバのシリコーンのシールの周りにわかるでしょう。プローブ組立前にこれらの条件を確認する失敗は、イメージング ハードウェアに深刻な被害とされる可能性があります。 廃棄物の貯留層に滴下アプライドがわかる、一度病巣と肺を取るし、イメージング プローブ本体の上部にアセンブリを取り付けます。 は、アセンブリ上でグラデーションのスタックをスライドし、プローブの上にグラデーションを座席します。相対位置とコイルの適切な接続の詳細写真、人工とプローブのハードウェア コンポーネント提供 ( 図 4). 5。氏の画像コレクションを実行する 磁石に組み立てられたプローブ穴挿入 場所分光計に近接プローブ本体穴磁石の下部に開始。 磁石の上部に開く穴を通る血流線の余分な長さをリトラクトします。 磁石進出プローブ本体穴穴の上から潅流線からさらにたるみを同時に除去しながらベースで利用可能な余裕期間のすべては灌流線から撮影されている、一度します。 Shim スタックの対応するスロットにプローブの基部に 2 本の固定ネジをスレッドします。 前に、灌流線のピンチまたは廃棄物の貯留層にアプライドの流出を確認することによりプローブの挿入中にねじれて行われていないを確認します 。 注: 障害による流出は MRI ハードウェアに灌流線とリスク壊滅的な被害に永久的な損傷で起因できることを確認する。 廃棄物の貯留層に戻りラインを終了する出納がない場合は、プローブ本体を外し、流量が再挿入を試みる前に再開したことを確認します。組み立て灌流システムおよびイメージ投射分光計のスケマティック レイアウトがされている 8 を前述します。 プローブ本体を接続する グラデーション チラーから流入と流出水行を添付します。 グラデーション チラー用ポンプをオンに水温度設定 (19 ° C) を確認します。 空気冷凍機ユニットから空気ホースのホースのクランプを使用してプローブ本体に接続します。 空気冷却装置の流れをノブ、" 1 " 位置。 プローブ本体に熱電対線をアタッチします。 無線周波数 (RF) プローブ本体の入力/出力をプリアンプから同軸ケーブルを添付 ' s プロトン (H) チャネル。 プローブ本体にグラデーションのアンプから電源ケーブルを接続します。 内の RF、キャビネットは B0 補償装置、3 つすべてのグラデーション アンプ (x、y、z)、マスター ユニットの電源を入れます 分光計を準備する コンソールで温度可変調整モジュールを使用して目的の穴温度を設定します。 (インピー ダンス) を一致し、プローブ内の可変コンデンサーを調整することによって (rf) 回路をチューニングします。これは、プローブ本体の基地でワンドを操作することで。 分光計の現在の設定を調整する ' s シム コイル サンプルで磁界の均一性を最大限にします。 画像コレクションの開始 磁石内サンプルの空間的な位置の穴を決定するためのパイロットの画像を収集します。2 つの標準のパラメーター次元グラジエント エコーは、次のとおりです (TR ・ TE = 100/4 ms、平均 = 1、パルス角度 = 30 o、時間 = 6 秒、行列 = 64 × 64、ビューのフィールド = 0.3 × 0.3 cm、解像度 47 x 47 μ m =)。。 は、該当する場合適切なスキャンの幾何学と組織の位置を確認するためにパイロットの拡散強調を収集します。2 つの標準のパラメーター次元拡散強調パイロット スキャンは、次のとおりです (TR ・ TE = 2000/11.6 ms、時間 = 4.3 分、Δ = 6 ms、δ = 1 ms、平均 = 1、b = 1200 (1860 付) s/mm 2、マトリックス = 64 × 64、ビューのフィールド = 0.2 x 0.2 cm。、解像度 31 μ m を =)。 急性スライス標本の安定性を決定する拡散強調の時系列を収集します。二次元拡散強調画像の一般的なパラメーターは次のとおりです。 (TR ・ TE = 2000/11.6 ms、時間 = 1.5 h、Δ = 6 ms、δ = 1 ms、平均 = 42, b = 1200 s/mm 2、マトリックス = 64 × 64、ビューのフィールド = 0.2 x 0.2 cm、解像度 = 31 μ m)。単位時間あたり MR 信号の変化と, 物理的な摂動注: (例えば T1、T2、拡散、感受性) の氏のコントラストを採用などの要因によって記述されているプロトコルから異なります特定のシステムで安定性を評価摂動は言ったから生じる。