Apoyo metabólico de suprimidos, los tejidos de cerebro vivos durante la adquisición de la microscopía de resonancia magnética

todos los experimentos con animales se describe seguir las directrices establecidas en las Academias nacionales de Ciencias de la ' Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron revisadas y aprobadas por la Universidad de Florida ' s Cuidado institucional de los animales y el Comité uso (IACUC). Siga todas las reglas y regulaciones al participar en investigación animal tema. 1. preparación de solución para el mantenimiento de los tejidos del sistema nervioso Central hacer fresco líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF). Para generar 2 L de solución tampón de bicarbonato aCSF, medir a 1.500 mL de agua purificada por doble destilación u ósmosis reversa en un frasco de 4 L. Colocar una barra de agitación magnética en el matraz y agite el líquido usando una placa de agitación. En el agua purificado, se disuelven las siguientes cantidades de sales: 14,03 g (120 mM) de cloruro de sodio, bicarbonato de sodio 4,37 g (26 mM), fosfato de potasio monobásico de 0,41 g (1,5 mM), 0,69 g (1,4 mM) sulfato de magnesio heptahidratado, calcio 0,59 g (2 mM) dihidrato del cloruro, 0,45 g (3 mM) de cloruro de potasio y glucosa de 3,6 g (10 mM). Nota: El contenido químico de la solución será diferente dependiendo de las necesidades metabólicas del tejido y las condiciones deseadas del experimento. Homogeneizar esta solución hasta que todas las sales se disuelvan. Ajustar el volumen de 2 L usando agua purificada adicional. Prueba la osmolalidad de la aCSF utilizando un osmómetro de depresión del punto de congelación. Ajustar a 300 mOsm/kg con sorbitol. Además de sorbitol 324 mg a 2 L de 299 mOsm/kg aCSF solución aumentará la osmolaridad 300 mOsm/kg (aproximadamente 1 mOsm por 324mg). Nota: La aCSF puede almacenarse a 4 ° C en un frasco hermético, cerrado por un período no debe exceder de 24 h. 2. Establecido por el sistema de perfusión preparar la solución de la aCSF. ACSF equilibrar a temperatura ambiente (~ 23 ° C) mientras que gasear con carbogen 95% (95% O 2, 5% CO 2; 1/16 L/min) por propagación directa de no menos de 1 h. Nota: Tipos de tejido diferentes o deseadas condiciones experimentales pueden requerir el ajuste de los contenidos de gas o la temperatura de solución. Las condiciones deseadas para el contenido de gas disuelto en la solución pueden ser controladas precisamente variando las concentraciones porcentuales de los componentes individuales de la gas ( figura 1). Una vez que la aCSF alcanza la temperatura deseada y la saturación de carbogen, confirmar que el pH está en el rango fisiológico (7.3-7.4). Continúan gas burbuja directamente en el tanque de solución (1/16 L/min) durante todo el experimento con el fin de mantener el propio oxígeno disuelto contenido y condiciones de pH favorables para el metabolismo de tejido sano. Prime las líneas de perfusión. Sumerja el tubo de entrada conectado a la bomba peristáltica de micro en la aCSF preparado (300 mOsm, pH 7.3-7.4, continuamente gaseado). Dispositivo de paso el oxigenador ( figura 2) y líneas de perfusión a través de ambos el imán agujero y bobina de gradiente pila (arriba abajo) y las bobinas a un lado hasta el montaje de la sonda. Colgar el oxigenador por encima de un vaso de precipitados para coger cualquier efluente aCSF. Nota: Dependiendo del diseño del sistema de MRI, las líneas de perfusión deba pasar a través del alesaje de imán y bobinas de gradiente o sonda cuerpo base antes de purgado del sistema con aCSF. Confirmar que colocación de la línea de perfusión no interferirá con la Asamblea del cuerpo de la sonda o la inserción de la sonda en el agujero antes de iniciar el procedimiento de cebado. Confirmar el caudal previsto (2 mL/min) es seleccionado y comenzar a llenar las líneas de perfusión de encender la bomba. Invertir la trampa de la burbuja vacía en línea para que aCSF desplazará el aire contenido dentro de. Conectar el oxigenador ' s gas puerto a una segunda fuente de carbogen (un colector o un cilindro secundario carbogen) y fijar un caudal de 1 / 16L/min Confirmar que carbogen está fluyendo sobre el oxigenador ' membrana de intercambio de gases s sumergiendo la lumbrera de escape en la parte superior el oxigenador en el agua. Una vez aCSF es detectado de la cámara de perfusión, purgar las burbujas de gas visible de las líneas de flujo por agitación manual. Confirmar el funcionamiento del oxigenador sumergiendo el electrodo de oxígeno en la aCSF que fluye de la cámara de perfusión. Nota: La lectura en el medidor de oxígeno debe aproximar el porcentaje de oxígeno contenido en el gas suministrado. 3. Preparación de tejido eutanasia lugar una rata (125-150 g) en la cámara de inducción de una máquina de anestesia y exponer a 4% de isoflurano en un portador de oxígeno gas a una velocidad de 1 L/min durante 4 min. Quite la rata inconsciente de la cámara de anestesia. Pruebe righting reflex al colocar la rata en la posición supina. Busque cualquier movimiento — cabeza giro, elevación de piernas, columna vertebral flexión, etc. — indicativo que el animal se está convirtiendo en su estómago. Realizar una prueba reflexiva de parpadeo al tocar el ojo del animal utilizando un hisopo de algodón. Busque cualquier respuesta — tapa cierre, fasciculaciones musculares, etc. — a esta sensorial. Por último, realizar un test reflejo de retirar miembro pellizcando la piel entre los dedos de la rata ' s extendidos pata trasera usando pinzas o pinzas hemostáticas. Compruebe la flexión de la Leg Nota: en el caso de un resultado positivo reflexiva, no se debe proceder con la eutanasia. En caso de que cualquiera de las tres pruebas de reflejas produce una respuesta, devolver inmediatamente la rata a la cámara de anestesia y permite un adicional 2 min de exposición a 4% de isoflurano. Exámenes de todos tres reflexiva sobre en su totalidad. Repetir la exposición de anestesia de 2 min si es necesario y sólo procede una vez se ha observado una total falta de respuesta a todas las tres pruebas reflexivas. Eutanasia a la rata mediante decapitación guillotina. Resección cerebral quitar el cerebro de la rata por disección bruta. Comience con la cabeza en la posición propensa. Con unas tijeras, cortar rostral a través de la piel de la parte posterior del cuello a la nariz y exponer el cráneo. Retirar los tejidos blandos de la superficie del cráneo con una sonda Roma. De trabajo desde el extremo caudal, quitar el occipital, parietal y los huesos frontales del cráneo usando gubias. Retraer la duramadre cortando a lo largo de la fisura longitudinal con micro tijeras y despegando la capa desde ambos hemisferios. Quitar el cerebro del cráneo girando la cabeza a la posición supina y cortar los nervios craneales en el lado ventral. Segmento aislamiento el cerebro a la posición prona y aislar la porción central que contiene el hipocampo mediante la eliminación de todos los tejidos caudales a la fisura transversal y rostrales a la fimbria. Hacer dos cortes a lo largo de un plano transversal (es decir, cortes coronal) con una navaja de borde recto. Afijo el cerebro ' plano de más caudal de s al centro del baño vibratome corte usando el pegamento del cianocrilato. Agregar helado, carbogen burbujas aCSF al baño vibratome corte y colocar el hardware de retención de nylon en. Rodajas de corte 300 μm para obtener preparaciones de 3 a 4 rebanada usable por hemisferio (6 a 8 en total). Aislar un hipocampo o sección cortical de un hemisferio y recortar el trozo para que se ajuste al microcoil ' tejido de diámetro de 5 m m s bien. 4. Colocación y montaje de sistema de perfusión de la muestra preparación de la bobina llene la microcoil ' cámara de tejido s con oxigenada aCSF desde el vibratome ' baño de corte de s con una pipeta de transferencia. Tomar la muestra de cerebro recortado y posición de la región de interés (ej. capa de células piramidales) sobre el microcoil de transcatheter usando un disección alcance. Inserte el dispositivo de retención de tejido (malla de nylon neto en arandela de nylon) para conservar la posición de la muestra durante todo el experimento de la proyección de imagen. Nota: Proceder rápidamente a través de la muestra procedimiento para minimizar la exposición a luz intensa de posicionamiento. Proporcionar aCSF oxigenada adicional según sea necesario utilizando una pipeta de transferencia. Montaje de la en-agujerea oxigenador, microcoil de transcatheter y sonda asegure el microcoil modificada ( figura 3) en una mordaza de mesa y fije el dispositivo oxigenador en el agujero mediante la inserción de la clavija soporte de acetal en el agujero encima de la bobina. Sellar el sistema de perfusión mediante la colocación de la cámara de perfusión sobre el microcoil ' tejido s así y con cincha las dos juntas con un lazo de cable miniatura. Recortar el exceso de longitud de la atadura de cables usando cortadores de alambre. Nota: Sobre sellado exitoso, solución debe observarse saliendo a través de las líneas de salida y no hay fugas deben ser evidente alrededor de la goma de silicona de la cámara de perfusión. Para confirmar estas condiciones antes del montaje de la sonda podría resultar en serios daños al hardware de la proyección de imagen. Una vez aCSF puede verse gotas en el depósito de residuos, el microcoil de transcatheter y oxigenador y Anexe el montaje a la parte superior de la imagen corporal sonda. Deslice la pila de gradiente sobre la Asamblea y el gradiente en la cima de la punta de prueba del asiento. Fotografías detallando la posición relativa y adecuada conexión de la bobina, oxigenador y punta de prueba de componentes de hardware son proporcionados ( figura 4). 5. Realizar la colección de imágenes de Señor Insertar la sonda montada en el imán del alesaje lugar el cuerpo de la sonda en proximidad cercana al espectrómetro dio apertura en la parte inferior del imán. Retraer el exceso de longitud de las líneas de perfusión a través del ánima de apertura en la parte superior del imán. Una vez que todos la holgura disponible ha sido tomado de las líneas de perfusión, avance del cuerpo de la sonda en el imán dio en la base mientras que simultáneamente quita más floja de las líneas de perfusión de la parte superior del alesaje. Enrosque los dos tornillos de fijación en la base de la sonda en las ranuras correspondientes de la pila de shim. Antes de continuar, compruebe que las líneas de perfusión no fueron atrapadas o dobladas durante la inserción de la sonda confirmando aCSF salida en el depósito de residuos. Nota: Si no se confirma la salida de la solución puede resultar en daño permanente a perfusión líneas y riesgos catastróficos daños a Sr. proyección de imagen hardware. En caso de que ninguna solución se ve salir de la línea de retorno en el depósito de residuos, retire el cuerpo de la sonda y confirmar que el flujo de solución ha reiniciado antes de intentar la reinserción. Un diseño esquemático del espectrómetro de sistema y la proyección de imagen de perfusión ensamblado ha sido descrito previamente 8. El cuerpo de la sonda de conexión Conecte las líneas de agua de entrada y salida de la enfriadora gradiente. Encender la bomba para refrigerador de gradiente y confirme el ajuste de temperatura de agua (19 ° C). Conecte la manguera de aire de la unidad enfriadora de aire en el cuerpo de la sonda utilizando una abrazadera. La perilla del caudal en la unidad de enfriador de aire para el " 1 " posición. Fijar el alambre del termopar para el cuerpo de la sonda. Conecte el cable coaxial desde el preamplificador a la radiofrecuencia (RF) entrada/salida en el cuerpo de la sonda ' canal de protones (H) s. Conecte el cable de alimentación de los amplificadores gradiente al cuerpo sonda. Dentro de la RF gabinete, conecte la alimentación a la unidad de compensación de B0, todos los amplificadores gradiente tres (x, y, z) y la unidad principal. Preparando el espectrómetro temperatura el agujero previsto mediante el módulo de ajuste de temperatura variable en la consola. Emparejar (impedancia) y sintonizar circuito (frecuencia) de la RF mediante el ajuste de los condensadores variables dentro de la sonda. Esto se logra mediante la manipulación de las varillas en la base del cuerpo sonda. Ajustar la configuración actual para el espectrómetro ' bobinas de espesor s para maximizar la homogeneidad del campo magnético en la muestra. Colección de imágenes de comenzar recoger imágenes piloto para determinar la posición espacial de la muestra dentro del imán del alesaje. Parámetros típicos para dos dimensiones del eco del gradiente son los siguientes (TR/TE = 100/4 ms, promedio = 1, ángulo de pulso = 30 o, tiempo = 6 seg, matriz = 64 x 64, campo de visión = 0.3 x 0.3 cm, resolución = 47 x 47 μm). Recoger difusión-cargado pilotos para confirmar la exploración adecuada geometría y tejido posición si procede. Parámetros típicos para dos análisis piloto difusión-cargado dimensional son las siguientes (TR/TE = 2000/11.6 ms, tiempo = 4,3 min, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, promedio = 1, b = 1200 (a partir de 1860) s/mm 2, matriz = 64 x 64, campo de visión = 0.2 x 0.2 cm resolución = 31 μm). Recoge una serie de tiempo de difusión-cargada para determinar las características de estabilidad de la preparación de corte agudo. Parámetros típicos para una imagen de dos dimensiones difusión ponderada están la siguiente (TR/TE = 2000/11.6 ms, tiempo = 1,5 h, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, promedio = 42, b = 1200 s/mm 2, matriz = 64 x 64, campo de visión = 0.2 x 0.2 cm, resolución = 31 μm). Nota: Caracterización de la estabilidad en un sistema dado variará del protocolo descrito dependiendo de factores como el contraste de Señor empleado (por ejemplo, T1, T2, difusión, susceptibilidad), la perturbación física estudiada y el Señor cambio la señal por unidad de tiempo resultantes de perturbación, dijo.