O atual protocolo descreve um método pelo qual os usuários podem manter viabilidade de preparações de fatias hippocampal e cortical aguda durante a coleta de dados de microscopia de ressonância magnética.
Este protocolo descreve os procedimentos necessários para apoiar as funções metabólicas normais das preparações de fatia cerebral aguda durante a coleta de dados de microscopia de ressonância magnética (RM). Embora seja possível executar o senhor coleções em tecidos de mamíferos vivos, extirpado, tais experiências têm sido tradicionalmente restrita pelos limites de resolução e, portanto, são incapazes de visualizar a microestrutura de tecido. Por outro lado, protocolos de deputado que uma resolução imagem microscópica exigido o uso de amostras fixas para acomodar a necessidade de condições estáticas, imutáveis dos tempos de varredura longo. O atual protocolo descreve a primeira técnica de senhor disponível que permite que a imagem latente de amostras de tecido vivo e mamíferos em resoluções microscópicas. Tais dados são de grande importância para a compreensão de como patologia com base em alterações de contraste ocorrendo a influência nível microscópico o conteúdo de macroscópica senhor exames, tais como aqueles usados na clínica. Uma vez que tal entendimento é realizado, métodos de diagnóstico com maior sensibilidade e precisão podem ser desenvolvidos, o que irá traduzir diretamente para o tratamento de doenças anterior, mais acurada monitoramento da terapia e melhorou os resultados dos pacientes.
Enquanto a metodologia descrita centra-se sobre os preparativos de fatia do cérebro, o protocolo é adaptável a qualquer pedaço de tecido excisado, dado que as alterações sejam feitas preparações de gás e o perfusato para acomodar necessidades metabólicas específicas do tecido. Execução bem sucedida do protocolo deve resultar em preparações de fatia de vida, aguda que apresentam estabilidade de sinal do senhor difusão por períodos até 15.5 h. As principais vantagens do sistema atual sobre outros aparelhos de perfusão compatível do senhor são sua compatibilidade com o hardware de microscopia do senhor necessária para alcançar maior imagens de resolução e capacidade de oferecer fluxo constante, ininterrupto com cuidadosamente condições de perfusato regulamentado. Taxa de transferência de amostra reduzida é uma consideração com este projeto como fatia de apenas um tecido pode ser fotografada em um momento.
Como sistemas de ressonância magnética (MRI) progrediram constantemente para a intensidade de campo cada vez maiores, mais detalhes sobre a composição e estatuto dos tecidos vivos tornaram-se perceptíveis. Apesar de tais avanços de hardware, Sr. imagem latente em resolução suficiente para visualizar as estruturas celulares dos tecidos ainda não está disponível na clínica. Como resultado, a nível celular características dos tecidos devem ser inferidas quando se considera o conteúdo dos exames clínicos. Tal inferência requer conhecimento de processos equivalentes inferida a partir de dados obtidos em sistemas modelo que podem ser observados diretamente. Tradicionalmente, estes modelos incluíam células de organismos aquáticos, tais como o oócito Xenopus laevis e Aplysia californica L7 neurônio1,2. Estas estavam entre as primeiras células animais disponíveis para observação com métodos do senhor devido ao seu tamanho anormalmente grande: aproximadamente 1000 μm e 300 μm de diâmetro, respectivamente. Mais recentemente, avanços no design de hardware permitiram que um dos maiores exemplos de pilhas mamíferas — o neurônio motor α — para ser fotografada usando técnicas de microscopia do senhor no tecido fixo3,4. Enquanto estes estudos demonstraram a visualização directa de mamíferos material celular usando o senhor, as fixas amostras empregadas diferem significativamente em suas propriedades de senhor de tecido vivo e, portanto, não podem servir como um modelo representativo equivalente5, 6. Mais importante, observar alterações de contraste do senhor que ocorrem em conjunto com processos biológicos complexos requer exemplos de vida que podem ser perturbados e medidos ao longo da experiência de imagem.
Para facilitar estudos de microscopia do senhor sobre tecidos vivos, um protocolo é apresentado que inclui microfilmagem comercial ferragem7 interfaceado com um purpose-built, senhor compatível, no furo oxigenador e dispositivo de perfusão descritas anteriormente8 . Vantagens exclusivas deste projeto incluem capacidades de resolução de nível celular em tecidos de mamíferos e precisão controle sobre conteúdo de gás dissolvido e pH no local da perfusão do tecido. Além disso, ao contrário da maioria dos estudos de senhor de explant que interrompem a perfusão durante a aquisição de imagem para evitar artefatos de fluxo, este projeto suporta o uso de perfusão contínua durante a coleta de dados que foi mostrada para melhorar a condição fisiológica de isolado de tecidos9,10. Por último, sua gravação fechado câmara de retenção de fatia ferragem ajuda e reduzindo a probabilidade de artefatos de movimento que caso contrário poderia ocorrer durante prolongadas coleção de imagens.
Enquanto o atual protocolo descreve procedimentos apropriados para o uso com fatias hippocampal e corticais agudas, controle preciso sobre o perfusato metabolitos permite que este sistema acomodar uma ampla gama de tecidos de diversos tipos e condições experimentais. Limitações deste projeto incluem uma redução na taxa de transferência de amostra em comparação com uma perfusão de multi-slice câmara11; no entanto, esta limitação pode ser superada no futuro usando bobina multi matrizes.
Também, enquanto o sistema pode ser empregado em configurações horizontais ou verticais, o atual protocolo apresenta seu uso em um espectrômetro orientado verticalmente, de 600 MHz. Qualquer sistema capaz de estudos senhor microfilmagem — normalmente estreita-furo (≤6 cm), espectrómetros de alto campo (≥500 MHz) — acomodará o oxigenador e perfusão equipamentos descritos. No entanto, as alterações para a bobina de imagem, gradiente, sistema de sonda ou outro hardware de imagem essencial empregado podem necessitar de alterações para o equipamento de perfusão e parâmetros de verificação do senhor.
O atual protocolo descreve procedimentos necessários para a manutenção metabólica padrão de preparações de fatia cerebral aguda submetidos à microscopia de ressonância magnética. Este procedimento é o único método disponível que permite a visualização de tecidos de mamíferos vivos com o Sr em resoluções capaz de resolver as células. Enquanto as condições de perfusato descritas são adaptadas especificamente para os tecidos do sistema nervoso central, o protocolo é amplamente adaptável a qualquer modo de viver em preparação do tecido por meio de ajustes de constituintes de perfusato e gás, bem como a taxa de fluxo de perfusão e a temperatura.
Os problemas mais comuns susceptíveis de serem encontradas durante os procedimentos descritos incluem aqueles relacionados a falhas no fornecimento de metabólito. Precipitação de sais de cálcio pode ocorrer dentro da aCSF durante insuficiência gasosa como resultado de falhas em sistema de armazenamento em buffer o bicarbonato. Tais precipitados podem entupir as linhas de perfusão e resultar em danos ao hardware grave. Se sal precipitados são observados o perfusato após montagem de sonda, cessar o fluxo de perfusão imediatamente, desligando a bomba peristáltica. Confirme a presença de níveis suficientes de bicarbonato de sódio (4,37 g/2 L) no perfusato, CO2 níveis (5,0%) no abastecimento de gás e o fluxo de gás de carbogênio (1/16 L/min) no reservatório e oxigenador. Finalmente, confirme os níveis de pH são estabilizados no intervalo fisiológico (7.3-7.4). No caso em que os níveis de oxigênio gás e pH ainda não são regulados adequadamente, a membrana de troca de gás deve ser substituída.
Se fatias não apresentam estabilidade de sinal no tempo-curso experimental pretendido, confirme que o corretos constituintes químicos estão presentes na mistura aCSF e que a osmolalidade correta (300 mOsm) e pH (7.3-7.4) são mantidos. Também, certifique-se de carbogênio gás está a ser fornecida para o reservatório de perfusato e oxigenador em 1/16 L/min. Se estes passos não corrigir condições de perfusato, aconselha-se substituição da membrana de troca gasosa. Se a estabilidade do tecido não é alcançada após a solução de problemas nas condições de perfusato, considere refinamento do protocolo cirúrgico com foco em minimizar o intervalo de tempo entre a aplicação de colheita e perfusão do tecido.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por concessões do National Institutes of Health (NIH 1R01EB012874-01) (1R21NS094061-01A1) (S10RR031637) e o National Science Foundation (acordo de cooperação n º DMR-1157490) através do mecanismo de imagens avançado laboratório nacional de campo magnético elevado (NHMFL) de ressonância magnética e espectroscopia (AMRIS) em UF e o estado da Flórida.
Perfusate Preparation | |||
Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Slice Preparation | |||
Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Perfusion System | |||
Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MR Imaging Hardware | |||
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |