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Bioengineering

Metabolische Unterstützung der herausgeschnitten, lebendes Gehirn Gewebe während der Magnet-Resonanz-Mikroskopie-Akquisition

Published: October 18, 2017
doi:
10.3791/56282
, , , ,
1Department of Neuroscience,University of Florida, 2McKnight Brain Institute,University of Florida, 3Department of Biomedical Engineering,University of Florida, 4Center for Functionally Integrative Neuroscience,Aarhus University, 5Department of Radiology,University of Florida, 6National High Magnetic Field Laboratory,Florida State University

Summary

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode, mit der Benutzer Lebensfähigkeit der akuten hippocampal und kortikalen Slice Vorbereitungen bei der Sammlung von Magnet-Resonanz-Mikroskopie-Daten pflegen können.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren notwendig, um normalen Stoffwechselfunktionen der akuten Gehirn Slice Vorbereitungen bei der Sammlung von Magnetresonanz (MR)-Mikroskopie-Daten unterstützen. Es ist, zwar möglich, Herr Sammlungen auf lebendige, ausgeschnittenen Säugetier-Gewebe führen solche Experimente haben traditionell durch Auflösung Grenzen eingeschränkt worden und sind somit nicht in der Lage Gewebe Mikrostruktur zu visualisieren. Im Gegensatz dazu erforderte Herr Protokolle, die Auflösung des mikroskopischen Bildes erreicht haben den Einsatz von festen Proben, die Notwendigkeit der statischen, unveränderlichen Bedingungen über längere Scanzeiten unterzubringen. Das aktuelle Protokoll beschreibt die erste zur Verfügung Herr-Technik, die Bildgebung von lebenden, Säugetier-Gewebeproben mit mikroskopisch kleinen Auflösungen ermöglicht. Solche Daten sind von großer Bedeutung für das Verständnis der wie Pathologie-basierte Kontrast Veränderungen auf der mikroskopischen Ebene Einfluss die Inhalte des makroskopischen MR-Scans wie diejenigen in der Klinik. Einmal ein solches Verständnis realisiert, Diagnosemethoden mit größerer Empfindlichkeit und Genauigkeit entwickelt werden, die direkt zu früheren Behandlung, genauer Therapieüberwachung und verbesserte Behandlungsergebnisse übersetzen.

Während die beschriebene Methodik konzentriert sich auf Gehirn Slice Vorbereitungen, ist das Protokoll anpassbar an jede Scheibe ausgeschnittenen Gewebe, angesichts der Tatsache, dass an den Gas- und Perfusat Vorbereitungen Änderungen auf das Gewebe speziellen metabolischen Bedürfnisse anzupassen. Erfolgreiche Durchführung des Protokolls sollte Wohn-, akuten Slice Zubereitungen führen, die Herr Verbreitung Signalstabilität für Zeiträume bis zu 15,5 h aufweisen. Die Hauptvorteile des derzeitigen Systems über andere Herr kompatibel Perfusion Apparate sind seine Kompatibilität mit Herrn Mikroskopie benötigte Hardware, um höhere Auflösung und Fähigkeit, ständigen, ununterbrochenen Fluss mit sorgfältig zu erreichen geregelten Perfusat Bedingungen. Reduzierte Probendurchsatz ist eine Betrachtung mit diesem Entwurf, wie nur ein Gewebe Scheibe gleichzeitig abgebildet werden kann.

Introduction

Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) Systeme zu immer höheren Feldstärken stetig Fortschritte erzielt haben, sind weitere Informationen über die Zusammensetzung und Status der lebende Gewebe erkennbar geworden. Trotz solcher Hardware Fortschritte ist MR-Bildgebung bei Auflösungen ausreichen, um die zellulären Strukturen des Gewebes sichtbar zu machen in der Klinik noch nicht verfügbar. Infolgedessen müssen Mobilfunk-Ebene Eigenschaften des Gewebes abgeleitet werden, wenn den Inhalt der klinischen Scans in Betracht. Diese Folgerung erfordert Kenntnisse über entsprechende Prozesse entnommen aus Daten in Modellsystemen die direkt beobachtet werden kann. Diese Modelle enthalten traditionell Zellen von Wasserorganismen wie Xenopus Laevis Eizelle und Aplysia Californica L7 Neuron1,2. Diese gehörten zu den ersten tierischen Zellen verfügbar für die Beobachtung mit Herrn Methoden aufgrund ihrer untypisch Größe: ca. 1000 μm und 300 μm Durchmesser, beziehungsweise. Vor kurzem haben Fortschritte in der Hardware-Design für eines der größten Beispiele von Säugerzellen erlaubt – der α-Motoneuron —, abgebildet mit MR-Mikroskopie-Techniken auf fixierte Gewebe3,4. Während dieser Studien direkten Visualisierung der Säugetier-zellulares Material mit Herrn gezeigt, die örtlich festgelegten Proben beschäftigt unterscheiden sich erheblich in ihren Eigenschaften der Herr aus lebender Gewebe und somit nicht als ein gleichwertiges repräsentative Modell5dienen, 6. Noch wichtiger ist, erfordert die Beobachtung Herr Kontrast Veränderungen, die im Konzert mit komplexen biologischen Prozessen auftreten lebenden Proben, die beunruhigt und im Laufe der imaging Experiment gemessen werden können.

Um Herrn Mikroskopie Studien auf lebendes Gewebe zu erleichtern, präsentiert die kommerzielle Microimaging Hardware7 eine Schnittstelle zu einer speziell angefertigten, Herr kompatibel, in Bohrung Oxygenator und Perfusion Gerät zuvor beschriebenen8 enthält ein Protokoll . Einzigartige Vorteile dieser Bauweise gehören Mobilfunk-Ebene Auflösung Fähigkeiten in den Säugetier-Geweben und präzise Kontrolle über gelöstes Gas Inhalt und pH-Wert am Ort der Gewebedurchblutung. Auch, im Gegensatz zu den meisten Explant Herr Studien unterbrechen Perfusion während der Bildaufnahme, Fluss Artefakte zu vermeiden, dieses Design unterstützt die Verwendung von kontinuierlicher Perfusion während der Datenerfassung, das gezeigt worden ist, um den physiologischen Zustand zu verbessern isolierte Gewebe9,10. Zu guter Letzt seine geschlossene Aufnahme Kammer und Aufbewahrung von Slice Hardware Hilfe verringern die Wahrscheinlichkeit von Bewegungsartefakte, die sonst beim auftreten könnte langwierig Bildersammlung.

Während das aktuelle Protokoll Verfahren für die Verwendung mit akuten hippocampal und kortikalen Scheiben geeignet beschreibt, ermöglicht präzise Kontrolle über Perfusat Metaboliten dieses System eine breite Palette von unterschiedlichen Gewebetypen und experimentellen Bedingungen unterzubringen. Einschränkungen dieses Entwurfs sind eine Reduzierung Probendurchsatz im Vergleich zu einer Mehrschicht-Perfusion Kammer11; jedoch kann diese Einschränkung überwunden werden, in Zukunft mit Multi-Spule Arrays.

Während das beschriebene System in horizontale oder vertikale Konfigurationen eingesetzt werden kann, bietet das aktuelle Protokoll auch, seine Verwendung in einem vertikal ausgerichteten, 600 MHz-Spektrometer. Jedes System in der Lage, Herr Microimaging Studien – in der Regel schmal-Bohrung (≤6 cm), Hochfeld (≥500 MHz) Spektrometer-wird Platz für die Oxygenator und Perfusion Ausrüstung beschrieben. Jedoch erfordern Änderungen der bildgebenden Spule, Farbverlauf, Sondensystem oder anderen wesentlichen bildgebenden eingesetzten Hardware Änderungen der Perfusion Ausrüstung und MR-Scan-Parameter.

Protocol

alle Tierversuche beschrieben folgen die Vorgaben in den nationalen Akademien der Wissenschaften ' Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden überprüft und genehmigt von der University of Florida ' s Institutionelle Pflege der Tiere und Use Committee (IACUC). Befolgen Sie alle geltenden Regeln und Vorschriften beim engagieren in tierischen Thema Forschung. 1. Vorbereitung der Perfusat für die Wartung des Zentralnervensystems Gewebe machen frische künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS). 2 L Bicarbonat-gepufferte ACFS Perfusat generieren, Messen, 1.500 mL Wasser in einen 4 L Flasche durch doppelte Destillation und Umkehrosmose gereinigt. Legen Sie eine magnetische Stir Bar in der Flasche und schütteln die Flüssigkeit mit einer Platte rühren. In das gereinigte Wasser auflösen die folgenden Mengen von Salzen: 14,03 g (120 mM) Natrium-Chlorid, Natriumbicarbonat 4,37 g (26 mM), 0,41 g (1,5 mM) monobasic Kalium Phosphat, 0,69 g (1,4 mM) Magnesiumsulfat Heptahydrat, 0,59 g (2 mM) Kalzium Chlorid-Dihydrat, 0,45 g (3 mM) Kaliumchlorid und 3,6 g (10 mM) Glukose. Hinweis: Werden der chemischen Inhalt der Perfusat unterscheiden sich je nach den spezifischen metabolischen Anforderungen das Gewebe und die gewünschten Bedingungen des Experiments. Diese Lösung gründlich mischen, bis alle Salze aufgelöst haben. Stellen Sie Lautstärke auf 2 L mit zusätzlichen gereinigtes Wasser. Testen die Osmolalität der ACFS mit einem Gefrierpunkt Depression XR. Passen Sie auf 300 mOsm/kg mit Sorbit. Zugabe von 324 mg Sorbit, 2 L 299 mOsm/kg ACFS Perfusat Osmolalität bis 300 mOsm/kg (etwa 1 mOsm pro 324mg) erhöhen wird. Hinweis: Der ACFS kann gespeichert werden, bei 4 ° C in einer luftdichten, verschlossenen Flasche für einen Zeitraum von 24 Std. nicht überschreiten 2. Set Up the Perfusion System Vorbereitung der ACFS Perfusat. Äquilibriert ACFS auf Raumtemperatur (~ 23 ° C) während der Begasung mit 95 % Carbogen (95 % O 2, 5 % CO 2; 1/16 L/min) über direkte sprudeln für nicht weniger als 1 h Hinweis: Verschiedene Gewebearten oder gewünschte experimentellen Bedingungen erfordern Anpassung des Inhalts Perfusat Temperatur oder Gas. Die gewünschten Bedingungen für gelöstes Gas Inhalt in dem Perfusat gesteuert werden, gerade durch die Variation der prozentuale Konzentrationen einzelner Komponenten der Versorgung Gas ( Abbildung 1). Sobald der ACFS erreicht die gewünschte Temperatur und Carbogen Sättigung, bestätigen, dass der pH-Wert im physiologischen Bereich (7,3-7,4). Weiter Blase Gas direkt in das Perfusat Reservoir (1/16 L/min) im Laufe des Experiments um richtig gelösten Sauerstoffgehalt und pH-Bedingungen förderlich für gesundes Gewebestoffwechsel zu erhalten. Prime die Perfusion Linien. Submerge der Schlauch Mikro-Schlauchpumpe in die vorbereiteten ACFS (300 mOsm, pH 7,3-7,4 ans, kontinuierlich vergast). Pass der Oxygenator Gerät ( Abbildung 2) und Perfusion Linien durch die beiden Magneten trug und gradient Spule stapeln (von oben nach unten) und legen Sie die Spulen beiseite bis Sonde Vollversammlung. Hängen die Oxygenator über ein Becherglas um jede ACFS Abwasser zu fangen. Hinweis: Abhängig von der MRI-System-Design, können Perfusion Linien müssen durch die Magnetröhre und gradient Spulen oder Sondenkörper Basis vor dem Grundieren mit ACFS übergeben werden. Bestätigen, dass Perfusion Linie Placement beeinträchtigt nicht die Montage der Sondenkörper oder einführen der Sonde in die Bohrung vor Beginn des Verfahrens Priming. Bestätigen der gewünschten Durchfluss (2 mL/min) ausgewählt und Abfülllinien der Perfusion durch Einschalten der Pumpe beginnen. Die Blase leer, Inline-Falle zu drehen, so dass ACFS wird die Luft im Innern zu verdrängen. Verbinden die Oxygenator ' s gas-Port, um ein zweites Standbein Carbogen (einen Verteiler oder eine sekundäre Carbogen Zylinder) und legen Sie einen Durchfluss von 1 / 16L/min Bestätigen, dass Carbogen fließt über die Oxygenator ' s-Gas-Austausch-Membran durch den Auslass auf der Oberseite der Oxygenator ins Wasser eintauchen. Tropft aus der Perfusion Kammer ACFS erkannt, sichtbaren Gasblasen aus bereinigen Zufluss Linien durch manuelle Agitation. Bestätigen die Oxygenator ordnungsgemäß durch Eintauchen der Sauerstoff-Elektrode in der ACFS fließt aus der Kammer Perfusion. Hinweis: Sollte das Lesen auf dem Sauerstoff-Messgerät der Sauerstoffgehalt innerhalb des gelieferten Gases ungefähre. 3. Vorbereitung der Gewebe Euthanasie Ort eine Ratte (125-150 g) in die Kammer der Induktion einer Anästhesiegerät und Expose auf 4 % Isofluran in ein Sauerstoffträger gas mit einer Rate von 1 L/min für 4 min. Entfernen Sie die unbewusste Ratte aus der Narkose Kammer. Führen ein aufrichtendes Reflextest indem man die Ratte in der Rückenlage. Überprüfen Sie, ob alle Bewegungen — den Kopf drehen, Bein heben, Wirbelsäule, biegen usw. — hinweisend, die das Tier auf seinen Magen dreht. Einen Augenzwinkern reflexive Test durchführen indem Sie auf das offene Auge des Tieres mit einem Wattestäbchen. Überprüfen Sie bei jeder Antwort — Deckel Verschluss, Muskelzuckungen, etc. — zu dieser sensorischen Input. Führen Sie zu guter Letzt ein Glied zurückzutreten reflex-Test durch Kneifen die Haut zwischen den Zehen der Ratte ' s ausgestreckten hintere Bein mit einer Pinzette oder Futterzange. Überprüfen Sie, ob die Beugung der Leg Hinweis: bei positiven reflexive Testergebnis fahren Sie nicht mit Euthanasie. Den Fall, dass einer der drei reflex Tests löst eine Reaktion, die Ratte sofort an die Anästhesie-Kammer zurück und ermöglichen eine zusätzliche 2 min der Exposition gegenüber 4 % Isofluran. Führen alle drei reflexive Tests über in ihrer Gesamtheit. Wiederholen Sie die 2 min Anästhesie Belichtung wie nötig und nur fahren Sie anschließend ein völligen Mangel an Antwort auf alle drei reflexive Tests beobachtet wurde. Die Ratte über Guillotine Enthauptung einschläfern. Gehirn Resektion Rattengehirn durch grobe Dissektion zu entfernen. Beginnen Sie mit dem Kopf in der Bauchlage. Mit Schere, Rostral Schnitt durch die Haut von der Rückseite des Halses, der Nase und des Schädels aussetzen. Weichteile von der Oberfläche des Schädels mit einer stumpfen Sonde entfernen. Arbeiten aus dem kaudalen Ende, entfernen Sie die Occipital, parietalen und frontalen Knochen des Schädels mit Rongeurs. Einfahren die Dura entlang der longitudinalen Fissur mit Mikro Schere schneiden und schälen zurück die Schicht aus beiden Hemisphären. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel durch Drehen des Kopfes in Rückenlage und Durchtrennung der Hirnnerven auf der ventralen Seite. Scheibe Isolierung das Gehirn in Bauchlage zurückkehren und der Mittelteil mit dem Hippocampus durch Entfernen aller Gewebe kaudalen, quer Fissur und rostral zu den Fimbrien zu isolieren. Zwei Einschnitte entlang der Querebene (d.h. koronalen Scheiben) mit einem geraden Rasiermesser machen. Befestigen Sie das Gehirn ' s kaudalen-die meisten Flugzeug zur Mitte der Badewanne Vibratome schneiden mit Cyanacrylat-Klebstoff. Fügen Sie eiskalt, Carbogen sprudelte ACFS zum Vibratome schneiden Bad und legen Sie die Nylon-Retention-Hardware im Inneren. Cut 300 μm dicke Scheiben, 3 bis 4 nutzbare Slice Vorbereitungen pro Hemisphäre (6 bis 8 insgesamt) zu erhalten. Ein Hippocampus oder kortikale Abschnitt von einer Hemisphäre zu isolieren und die Scheibe zu trimmen, so dass sie in die Microcoil passt ' s 5 mm Durchmesser Gewebe gut. 4. Probieren Sie Positionierung und Perfusion Systemmontage füllen die mi Coil-VorbereitungCrocoil ' s Gewebe Kammer mit Sauerstoff angereichertes ACFS aus der Vibratome ' s schneiden Bad mit einer Transferpipette. Nehmen die getrimmte Gehirn und positionieren die Region von Interesse (zB. pyramidale Zellschicht) über die Microcoil über einen sezierenden Scope. Legen Sie das Gewebe Aufbewahrung Gerät (Nylon-Mesh net an Nylon Unterlegscheibe befestigt) Probenposition gesamten imaging Experiment behalten. Hinweis: Fahren Sie schnell durch die Probe Positionierung Verfahren um intensive Lichteinwirkung zu minimieren. Bedarf mit einer Transferpipette, zur Verfügung stellen zusätzliche sauerstoffreiches ACFS. Montage in Bohrung Oxygenator, Microcoil und Sonde sichern die modifizierte Microcoil Montage ( Abbildung 3) in eine Tischklemme und befestigen Sie das Gerät in der Bohrung Oxygenator durch Einfügen der Acetal Unterstützung Stift in das Loch auf der Spule. Perfusion System zu versiegeln, indem man die Perfusion Kammer über die Microcoil ' s Gewebe gut und die beiden zusammen mit einem Miniatur-Kabelbinder sichern. Schneiden Sie die überschüssige Länge aus den Kabelbinder mit Drahtschneider. Hinweis: Nach erfolgreicher Abdichtung Perfusat beachtet werden durch den Abfluss Linien und keine Leckage sollte offensichtlich um die Silikondichtung der Perfusion Kammer. Bestätigen Sie diese Bedingungen vor der Montage der Sonde Nichtbeachtung kann zu schweren Schäden zu imaging Hardware. Einmal ACFS tropft in den Abfall Behälter gesehen werden kann, nehmen Sie die Microcoil und Oxygenator und fügen Sie die Assembly an die Spitze der bildgebenden Sondenkörper. Schieben Sie den Farbverlauf Stapel über die Versammlung und Platz für die Steigung auf die Sonde. Fotos über die relative Platzierung und die korrekte Verbindung der Spule, Oxygenator und Sonde Hardware-Komponenten werden zur Verfügung gestellt ( Abbildung 4). 5. Durchführung der Herr Bildersammlung einlegen die montierte Sonde in den Magneten trug Ort der Sondenkörper in unmittelbarer Nähe zu dem Spektrometer trug Öffnung an der Unterseite des Magneten. Einfahren die überschüssige Länge der Perfusion Linien durch die Bohrung an der Spitze des Magneten öffnen. Sobald alle verfügbare Pufferzeit wurde aufgegriffen von der Perfusion Linien, Bohrung voraus den Sondenkörper in den Magneten an der Basis beim Entfernen von gleichzeitig mehr locker aus der Perfusion Linien von der Spitze der Bohrung. Fädeln Sie die beiden Befestigungsschrauben an der Basis der Sonde in die entsprechenden Schlitze des Stapels Shim. Bevor Sie beginnen, überprüfen Sie, ob Perfusion Linien waren nicht gequetscht oder beim Einführen der Sonde geknickt durch die Bestätigung der ACFS Abfluss in den Abfall Behälter. Hinweis: Die Nichtbeachtung bestätigen Perfusat Abfluss zu Perfusion Linien und Risiken katastrophale Schäden an MR-Bildgebung Hardware dauerhaften Schäden führen kann. Für den Fall, dass keine Perfusat gesehen ist die Rücklaufleitung in den Abfall Behälter verlassen den Sondenkörper entfernen und bestätigen, dass Perfusat fließen wieder aufgenommen hat, vor dem Versuch der Wiedereingliederung. Ein schematischer Aufbau des montierten Perfusion System und Imaging-Spektrometers wurde zuvor beschriebenen 8. Anschluss der Sonde Körper befestigen Sie die Wasserleitungen Zufluss und Abfluss von gradient Kältemaschine. Schalten Sie die Pumpe für gradient Kühler und bestätigen Sie die Einstellung der Warmwassertemperatur (19 ° C). Legen den Luftschlauch aus der Luft-Kühler-Einheit auf den Sondenkörper mit einer Schlauchklemme. Den Fluss Drehknopf am Kühler Lufteinheit, die " 1 " Lage. Legen den Thermoelement-Draht auf den Sondenkörper. Legen das Koaxial-Kabel aus der Vorstufe auf die Radiofrequenz (RF) ein-/Ausgänge auf den Sondenkörper ' s Proton (H) Kanal. Legen Sie das Netzkabel aus den Gradienten-Verstärkern auf den Sondenkörper. Im Inneren der RF Kabinett, schalten Sie die B0 Ausgleichseinheit, alle drei gradient Verstärker (X, y, Z) und der master-Einheit Bereitet das Spektrometer die vorgesehene Bohrung Temperatur mit variabler Temperatur Bedienmoduls an der Konsole einstellen. Übereinstimmen (Impedanz) und Stimmen (Frequenz) der RF-Strecke durch die Anpassung der Variable Kondensatoren in der Sonde. Dies geschieht durch die Manipulation der Stäbe an der Basis der Sondenkörper. Die aktuellen Einstellungen für das Spektrometer ' s Shim Spulen, die Magnetfeld-Homogenität bei der Probe zu maximieren. Beginnen Bildersammlung sammeln pilot Bilder bestimmen die räumliche Lage Ihrer Probe innerhalb des Magneten langweilen. Typische Parameter für zwei dimensionale gradient Echo sind wie folgt (TR/TE = 100/4 ms, Durchschnitte = 1, Puls Winkel = 30 o, Zeit = 6 Sec, Matrix = 64 x 64, Sichtfeld = 0,3 x 0,3 cm, Auflösung = 47 x 47 μm). Sammeln diffusionsgewichtete Piloten um die richtige Geometrie und Gewebe Suchposition ggf. bestätigen. Typische Parameter für zwei dimensionale diffusionsgewichtete pilot Scan sind wie folgt (TR/TE = 2000/11,6 ms, Zeit = 4,3 min, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, Durchschnitte = 1, b = 1200 (gültig ab 1860) s/mm 2, Matrix = 64 x 64, Sichtfeld = 0,2 x 0,2 cm Auflösung = 31 μm). Sammeln eine diffusionsgewichtete Zeitreihe ermitteln die Stabilität Eigenschaften der akuten Slice Zubereitung. Typische Parameter für eine zwei-dimensionale Verbreitung gewichteten Bild lauten wie folgt (TR/TE = 2000/11,6 ms, Zeit = 1,5 h, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, Durchschnitte = 42, b = 1200 s/mm 2, Matrix = 64 x 64, Sichtfeld = 0,2 x 0,2 cm, Auflösung = 31 μm). Hinweis: Stabilität in einem gegebenen System charakterisieren das beschriebene Protokoll abhängig von Faktoren wie der Herr Kontrast eingesetzt (z.B. T1, T2, Diffusion, Anfälligkeit), die körperliche Störung untersucht, und der Herr Signalwechsel pro Zeiteinheit variiert von infolge Störung sagte.

Representative Results

Perfusat Vorbereitung Nach erfolgreichen Beschäftigung des Gerätes in der Bohrung Sauerstoffversorgung werden Gase in den mitgelieferten Carbogen vorhanden 100 % Sättigung Bedingungen innerhalb der ACFS Perfusat erreichen. Dies kann durch Variation der Sauerstoffkonzentration des gelieferten Gases und Messung der Veränderung im gelösten Sauerstoffgehalt in der ACFS Perfusat innerhalb der Perfusion Kammer mit einer Sauerstoff-Messgerät (Abbildung 1)8nachgewiesen werden. Nach Henry Gesetz ist die Menge des gelösten Gases, die im Gleichgewicht mit einer flüssigen Probe ist direkt proportional zum Partialdruck des Gases, vorausgesetzt, die Temperatur konstant12 bleibt. Mit diesem Wissen und Präzision Gas-Standards, ist es möglich, die Menge an gelöstem Sauerstoff in einer ACFS Probe enthalten, wie beschrieben zu quantifizieren. Dies geschieht durch kalibrieren das Sauerstoff-Messgerät mit gesättigten Lösungen (direkt sprudelte für 1 Stunde oder mehr) der ACFS Gase bekannter Zusammensetzung ausgesetzt: ein Gas mit hoher Sauerstoffkonzentration wie Carbogen (95 % O2) und zum anderen mit wenig Sauerstoff Konzentration wie Stickstoff (0 % O2). Danach können Messungen durchgeführt werden, durch Eintauchen der Spitze von der Sauerstoff-Elektrode in einer Probe. Bestätigung, dass die in der Bohrung Oxygenator einwandfrei funktioniert kann durch Messung des Abwassers aus der Durchblutung gut erreicht werden. Der prozentuale gelöste Sauerstoff sollte das Sauerstoff-Messgerät gemessen die prozentuale Konzentration von Sauerstoff in die Versorgung Gas geliefert übereinstimmen. Wenn die gemessenen Werte niedriger als in der Versorgung Gas sind, würde dies einen Hardwarefehler vorschlagen, der zu metabolischen Insuffizienz in dem Gewebe-Segment führen könnte. Beispiel-Darstellung und das Verhalten Akuten Slice Vorbereitungen, die erhalten ausreichen, um Lieferung notwendigen Metaboliten und wegtragen Stoffwechselprodukte bald Perfusion erreichen einen Zustand der relativen Stabilität. Von diesem Punkt akute Scheiben können externe Störung ausgesetzt werden und ihre Reaktionen auf diese Veränderungen können für wissenschaftliche Studie gemessen werden. Für Herr Experimente ist das tracking des Signals von Interesse im Laufe der Zeit eine verbreitete Praxis, die relative Stabilität der akuten Slice Vorbereitungen13demonstrieren. Die diffusionsgewichtete Signal ist besonders empfindlich auf Veränderungen in einer Gewebes Wasser Mobilität, Inhalt und Verteilung, wie durch den Einsatz von diesem Kontrast Mechanismus zur Infarkte in ischämischen Schlaganfall14,15geschätzt werden kann. Plotten der normalisierten Diffusion-Signal im Laufe der Zeit in akuten kortikalen Scheiben unter einer Vielzahl von Perfusion Bedingungen aufrechterhalten zeigt relativ Stabilität (2 ± 3 % mehr als 15,5 h) nach Gewebe isoliert erreicht ist (Abbildung 5). Diffusion Signalstabilität blieb unabhängig von Perfusion Bedingungen (intermittierende oder kontinuierliche) oder MRI Scan Länge (kurze [4 min] oder lang [1,5 h])8. Wenn die Scheiben nicht ausstellen Signalstabilität im Laufe der Zeit, wie die scharfen Verbreitung Signal Zunahme lebenden Kortex, die keine Perfusion, erhielten ist dies suboptimale Versuchsbedingungen. Störung Experimente sollte nicht versucht werden, vor der Bestätigung des stabilen Signalbedingungen Slice Vorbereitungen. Neben Signalstabilität muss die richtige Probe Positionierung zum Zeitpunkt der Bildsammlung bestätigt werden. Obwohl Probenposition während der Gewebe Platzierung am sezierenden Mikroskop kontrolliert wird, können Veränderungen in der Probenort während der Montage der Perfusion Vorrichtung oder durch unsachgemäße Handhabung der Spule oder Sonde vor dem Einsetzen in den Magneten auftreten. Bestätigung der ordnungsgemäßen hippocampal Platzierung erreicht werden, durch das Sammeln von kurz (2 min), Pilot scannt mit Diffusion Kontrast (Abbildung 6). Da die pyramidale Zellschicht empfindlicher auf Diffusion Gewichtung als die angrenzenden hippocampalen Schichten ist, wird diese Struktur als dunkler Band in diffusionsgewichtete Bilder angezeigt. Setups, die keine dieses charakteristische Merkmal anzeigen außermittig Proben enthalten und müssen wiederholt werden. Abbildung 1: Gelöste Sauerstoffgehalt der ACFS Perfusat als Funktion der Prozent O2 -Gehalt im mitgelieferten Gas. Carbogen Mischungen, die Variable Konzentrationen von Sauerstoff (95 %, 60 % und 19 %) als ein Gas Versorgung eingesetzt werden. Prozent gelösten Sauerstoffs Lesungen sind dann die Durchblutung gut entnommen und im Vergleich zu zwei bekannte Kontrollen: Perfusat Reservoir sprudelte direkt mit Carbogen (95 % O2) und einem Perfusat Reservoir atmosphärischen Bedingungen (23 % O2 ausgesetzt ). In jedem Fall die Prozent Sauerstoffsättigung am Standort des Gewebes Perfusion Ansätze 100 % von der O2 -Konzentration in der Carbogen Mischung verwendet. Fehlerbalken sind gleich der Standardabweichung der Stichprobe Mittel. Abbildung mit freundlicher Genehmigung von der ursprünglichen Artikel8wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: schematische Zeichnung der Kammer in Bohrung Oxygenator und Perfusion. Dieses Diagramm zeigt detaillierte Design-Elemente für die Funktion dieser kritischen Geräte verantwortlich. Frische Perfusat, die durch eine Blase Falle gepumpt worden betritt der Oxygenator durch das obere Ende eines 10 mm-NMR-Röhrchen. Damit es Übergänge zu einem höchst Gas durchlässige Silikonschlauch (blauer Bereich), die um eine offene, 5 mm NMR-Rohr aufgewickelt wird verschachtelt. Carbogen Gas geliefert durch die Oberseite des Rohres 5mm betritt die Kammer durch den offenen Boden und geht über die aufgerollte Silikonschlauch vor dem Beenden der Oxygenator durch eine Entlüftungsöffnung im Rahmen der GAP 10 mm Rohr. Während dieser Ausstellung wird die Perfusat fließt durch den Silikonschlauch mit der chemischen Komponenten des mitgelieferten Gasgemisches gesättigt. Beim Verlassen der Oxygenator, geht Perfusat direkt in die Perfusion Kammer vor dem Eintritt in die Rücklaufleitung führt zu einem Müllabfuhr-Reservoir. Weitere Komponenten entscheidend für dieses Design sind die Acetal Unterstützung Peg ermöglicht dem Oxygenator vertikal stehen oben auf der modifizierten RF Microcoil, Silikon Unterlegscheibe (roter Ring) bildet die flüssigkeitsdicht Dichtung zwischen dem Oxygenator Perfusion Kammer und Das Microcoil Gewebe gut und die Kabelbinder Notch die Platzierung einer Kabelbinder verwendet, um diese reversible Dichtung bilden beherbergt. Diese Zahl wurde modifiziert und reproduziert mit freundlicher Genehmigung von der ursprünglichen Artikel8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Änderungen in der Microcoil Versammlung die Schnittstelle, die in der Bohrung Oxygenator erlauben. Zwei Nuten 3,0 x 1,5 mm wurden (schwarze Pfeile) schneiden, in der Seite der Baugruppe, die die Breite einer Kabelbinder zum Abdichten der Perfusion Kammer unterzubringen. Ein Kanal (15 x 3 x 4 mm) verbindet die Haine über die hintere Fläche der Spule. Zwei Nylon-Flächen platziert in den Seiten des Kanals (rote Pfeile) Act als einen Haken für den Kabel-Krawatte-Kopf die Abdichtung Verfahren erleichtert. Eine Bohrung (2 x 14 mm) im oberen Teil der Spule-Baugruppe (gelbe arrIE) unterstützen Verknüpfungen zu den Acetal Pflock um die Oxygenator zu sichern. Diese Zahl wurde modifiziert und reproduziert mit freundlicher Genehmigung von der ursprünglichen Artikel8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Foto-Montage, die detailliert die relative Platzierung und korrekte Montage von Microcoil, Oxygenator und Sonde Komponenten. Diese Bilder verfügen über wichtige Hardware-Komponenten des Gerätes in der Bohrung Oxygenator und Microperfusion und veranschaulichen, wie die einzelnen Teile miteinander Schnittstelle. (A) Explosionszeichnung Foto zeigt die relative Platzierung aller Komponenten vor der Versiegelung des Gewebes gut oder Montage von den Sondenkörper. Sorgfalt, die relative Lage der Teile korrekt anzuzeigen; jedoch ist ein Teil der Perfusion Linien zurück in dieser Serie verdoppelt worden, so dass alle Komponenten in den Bildrahmen passen. (1 = Messkopf, 2 = Microcoil Versammlung, 3 = Nylon Gewebe Aufbewahrung Ring, 4 = Perfusion gut, 5 = Kabelbinder, 6 in Bohrung Oxygenator, 7 = = gradient Spulen, 8 = Blase Falle). (B) Komponenten nach der Spule und Oxygenator Montage. In diesem Bild wurde der Nylonring Aufbewahrung innerhalb der Microcoil Gewebe gut um eine Probe zu sichern gelegt. Acetal Unterstützung Peg auf der Basis der Oxygenator wurde in die entsprechende Öffnung an der Oberseite der Microcoil gesichert. Die Silikon-Dichtung auf das offene Ende der Durchblutung gut über das Gewebe gut platziert wurde, und ein Kabelbinder wurden verschärft, um diese Komponenten, die Perfusion Kammer zu versiegeln. Zu guter Letzt ist die Basis der Microcoil an die Spitze der Messkopf angeschlossen. (C) Komponenten nach der Montage der Sonde. Im letzten Panel hat Überlänge von den Kabelbinder bündig mit der Microcoil getrimmt wurde. Der gradient Spule Stapel wird dann in Position geschoben, durch sorgfältig Vorschieben des Zylinders in Richtung der Sonde beim passieren der hohle Mitte die überschüssige Perfusion Linien, Oxygenator und Microcoil. Sobald die Gradienten der Messkopf angeschlossen sind, sind sie durch Verschrauben des Sicherungen Kragens auf der Sonde über die Gewinde Basis der Gradienten in Position gehalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: Diffusion Signalstabilität in unterkühlte akute kortikalen Scheiben. (A) Normalized Wert für diffuses Licht Signal in vier akuten Scheiben zu unterschiedlichen superfusion Paradigmen unterzogen werden im Laufe der Zeit für einen Zeitraum von bis zu 21,5 h nach Euthanasie geplottet. Scheiben bleiben innerhalb von ± 5 % von ihrer anfänglichen Verbreitung Signalmessung für einen Zeitraum von 15,5 h nach Euthanasie unabhängig davon, ob superfusion ist kontinuierlich oder intermittierend und unabhängig von der Herr-Scan-Länge (1,5 h oder 4 min). Signal-Aufnahmen von Formaldehyd-feste Rinde dienen als die positive Kontrolle (n = 1) für die Stabilität aufgrund der statischen, unveränderlichen festen Gewebeproben. Umgekehrt, Verbreitung Signal gemessen in einer live Scheibe fehlt der superfusion Unterstützung (n = 1) dient zur Kontrolle für metabolische Mangel. Experiment-Parameter der verschiedenen superfusion Studien sind wie folgt: kontinuierliche (superfusion immer pünktlich, pro Scan = 1,5 h), intermittierende (superfusion auf für 10 min Intervall zwischen den Scans, Zeit pro Scan = 1,5 h), lange Intervall, lange Scan (Superfusion auf während Scan, aber für 10 min zwischen den Scans, pausierte Zeit pro Scan = 1,5 h), lange Intervall, kurze Scan (superfusion auf für 1,5 h Intervall zwischen den Scans, Zeit pro Scan = 4 min). (B) analysiert Daten zeigen Gruppe bedeutet der vier live-Scheibe superfusion Experimente vom Panel (A). Die Diffusion signal Profil aus den gruppierten, unterkühlte kortikale Scheiben zeigt wenig Veränderung im Laufe der Zeit (2 ± 3 % über 15,5 h), während das Steuerelement nicht durchblutet (n = 1) weist dramatische Signal Instabilität frühzeitig in das Experiment (15 % von 6,5 h). Diese Zahl wurde modifiziert und reproduziert mit freundlicher Genehmigung von der ursprünglichen Artikel8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6: Bestätigung der hippocampalen Slice Platzierung während der pilot Bildgebung. Vor dem Ausführen einer erweiterten Herr Mikroskopie Sitzung, sind die korrekte Platzierung der Probe ist entscheidend, um Ressourcen wie z. B. Scanner Zeit gewährleisten und teure Perfusat Zusatzstoffe nicht vergeudet werden. Der pyramidenförmige Zellschicht in der CA1-Region des Hippocampus schneller (4,3 min) visualisiert werden, niedriger Auflösung (31 μm X 31 μm in der Ebene) pilot Scans um sicherzustellen, dass das Gewebe von Interesse in Bezug auf die Mikro-Spule korrekt platziert ist. Scan-Parameter für beide Bilder sind wie folgt: TR/TE = 2000/11,6 ms, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, Durchschnitte = 1. (A) b = 0 (227 wirksam) s/mm2. In diesem vorläufigen Scan ist das Stratum Pyramidale gerade erst als ein grauer, Diagonale Band zentriert in der Spule Erregung Profil sichtbar. (B) b = 1.200 (1.860 wirksam) s/mm2. Höhere Verbreitung Gewichtung, interlamellar Kontrast erhöht, da die pyramidale Zellschicht als Gewebe in der angrenzenden Schichten dunkler wird (oben: Stratum Oriens; unten: Stratum Radiatum). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Das aktuelle Protokoll beschreibt Verfahren für metabolische Standardwartung akute Gehirn Slice Vorbereitungen in der Magnet-Resonanz-Mikroskopie. Dieses Verfahren ist die einzige derzeit verfügbare Methode, die Visualisierung der lebenden Säugetieren Gewebe mit Herrn bei Auflösungen Zellen auflösen kann. Während die beschriebenen Bedingungen Perfusat speziell auf Zentralnervensystem Gewebe zugeschnitten sind, das Protokoll ist allgemein anpassungsfähig an irgendeiner Art und Weise des Lebens Gewebe Vorbereitung durch Anpassungen der Perfusat und Gas Bestandteile sowie Perfusion Durchfluss und Temperatur.

Die häufigsten Probleme bei dem beschriebenen Verfahren auftreten gehören im Zusammenhang mit Ausfällen in Metabolit Versorgung. Ausfällung von Calciumsalzen kann innerhalb der ACFS während gasförmige Insuffizienz durch Ausfälle in das Bikarbonat Pufferung System auftreten. Diese Ausscheidungen können verstopfen die Perfusion Linien und schweren Hardwareschäden führen. Wenn Salz Ausscheidungen in die nach der Montage der Sonde Perfusat beobachtet werden, unverzüglich Perfusion fließen durch die peristaltischen Pumpe ausschalten. Bestätigen Sie Vorhandensein von ausreichenden Natriumbicarbonat Niveaus (4,37 g/2 L) im Perfusat, CO2 -Konzentration (5,0 %) in Versorgung Gas und Carbogen Gas fließen (1/16 L/min) in Reservoir und Oxygenator. Bestätigen Sie abschließend, dass pH-Werte im physiologischen Bereich (7,3-7,4) stabilisiert werden. Die Gas- und pH-Wert Sauerstoffgehalt noch nicht angemessen reguliert werden, sollte die Gas-Austausch-Membran ersetzt werden.

Wenn Scheiben Signalstabilität nicht über den geplanten experimentellen Zeitverlauf ausstellen, bestätigen Sie, dass die richtigen chemischen Bestandteile in der ACFS Mischung vorhanden sind und die richtigen Osmolalität (300 mOsm) und pH (7,3-7,4) gepflegt werden. Stellen Sie außerdem sicher, dass Carbogen Gas Perfusat Reservoir und Oxygenator bei 1/16 L/min versorgt wird. Wenn diese Schritte nicht Perfusat Bedingungen korrigieren, empfiehlt Ersatz der Gasaustausch Membran. Sollten Sie Gewebestabilität nicht erreicht wird, nach der Fehlerbehebung Perfusat Bedingungen, Verfeinerung des chirurgischen Protokolls mit einem Fokus auf die Zeitspanne zwischen Ernte und Perfusion Anwendung Gewebe zu minimieren.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637) und der National Science Foundation (Kooperationsvertrag Nr. DMR-1157490) durch die nationale hohe magnetische Feld Labor (NHMFL) erweiterte Magnetic Resonance Imaging und Spektroskopie (AMRIS) Anlage UF und der Zustand von Florida.

Materials

Perfusate Preparation
Osmette A Precision Systems Inc. 5002 freezing point depression osmometer
Stir Plate Type 1000 Barnstead/Thermodyne SPA1025B magnetic stir plate with heating element
Accumet Basic pH Meter Fisher Scientific AB15 pH Meter
pH Probe Fisher Scientific 13-620-AP61 probe for pH measurement
Oxygen Meter Microelectrodes Inc. OM-4 meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates
Oxygen Electrode Microelectrodes Inc. MI-730 microprobe for the oxygen meter
Scale Denver Instrument Co. A-160 microscale for weighing chemical components
Name Company Catalog Number Comments
Slice Preparation
Lancer Vibratome Ted Pella Inc. Series 1000 vibratory tissue slicer
Disecting Microscope Carl Zeiss Inc. OPMI 1-FC tabletop, binocular disecting microscope
Name Company Catalog Number Comments
Perfusion System
Masterflex L/S Cole-Parmer 7523-50 peristaltic micro perfusion pump
Oxygen Regulators x 2 Victor Medical VMG-05LY device for regulating gas flow
e-sized carbogen cylinders x 2 Airgas gas tanks containing carbogen gas
in-bore oxygenator developed in house device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate
Name Company Catalog Number Comments
MR Imaging Hardware
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) Bruker Biospin B6371/0001 four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil
Micro 5 probe body Bruker Biospin Z3395 microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer
Micro 5 gradient coils Bruker Biospin M81111 gradient coil stack used with micro 5 probe body
600 MHz Spectrometer Oxford Instruments superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation
Imaging Console Bruker Biospin Avance III support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation
Air Blower Bruker Biospin BCU-II, -80/60 Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore
Gradient Chiller Thermo Scientific Neslab Merlin M33 Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils
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References

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Magnetic Resonance MicroscopyMetabolic SupportArtificial Cerebrospinal FluidCarbogenOxygenatorPeristaltic PumpFlow RateBubble Trap

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Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition. J. Vis. Exp. (128), e56282, doi:10.3791/56282 (2017).
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