تحديد المواقع صبغية أمثل لعنصر الحمض النووي في الإشريكيّة القولونية باستخدام نهج ينقول بوساطة جديدة
Summary
هنا، استخدمت السلطة من الإدراج عشوائي ينقول بوساطة عنصر الحمض النووي غير الترميز حل موقفها صبغية أمثل.
Abstract
كان المواقف صبغية أمثل لعنصر محدد من الحمض النووي/هي التي تحدد الإدراج عشوائي بوساطة ينقول متبوعاً بالتحديد اللياقة البدنية. في البكتيريا، يمكن أن يكون أثر سياق الوراثية على وظيفة عنصر الوراثية صعوبة تقييم. عدة آليات، بما في ذلك آثار طوبولوجي، تدخل النسخي من الجينات المجاورة، و/أو جرعة الجينات المرتبطة النسخ المتماثل، قد تؤثر على وظيفة عنصر وراثية معينة. هنا، يمكننا وصف أسلوب يسمح بإدماج عنصر الحمض النووي عشوائي في كروموسوم الإشريكيّة القولونية وتحديد المواقع الأكثر ملائمة مسابقة نمو بسيط باستخدام التجربة. الأسلوب الذي يستفيد من نظام قائم على أساس ينقول وصف جيد للإدراج عشوائية، إلى جانب مجموعة مختارة من clone(s) الأصلح بميزة النمو، هو إجراء قابل للتعديل بسهولة إلى الاحتياجات التجريبية. ويمكن تحديد طبيعة clone(s) الأصلح بتسلسل الجينوم كلياً على سكان متعددة الاستنساخ معقدة أو بالجينات من السهل سيرا على الأقدام للتعرف السريع على استنساخ المحدد. هنا، كمنطقة الحمض النووي غير الترميز DARS2، التي تتحكم في بدء النسخ المتماثل كروموسوم في كولاي، على سبيل مثال. وظيفة DARS2 المعروف أن تتأثر بالجينات المرتبطة بتكرار الجرعة؛ يحصل توثيق DARS2 الأصل لتكرار الحمض النووي، فإنه يصبح أكثر نشاطا. تم إدراج DARS2 عشوائياً في الكروموسوم من DARS2-حذف السلالة. المستنسخين الناتجة التي تحتوي على الإدخالات الفردية المجمعة وتتنافس ضد بعضها البعض لمئات الأجيال. وأخيراً، تتسم المستنسخين الأصلح وتبين تحتوي على DARS2 إدراجها بالقرب من الموقع الأصلي DARS2 .
Introduction
يمكن أن تتأثر وظيفة أي عنصر الوراثية إلى موقعها في الجينوم. في البكتيريا، وهذا ينتج أساسا من التدخل بالنسخ من الجينات المجاورة والمحليه الحمض النووي طبولوجيا الجرعة الجينات المرتبطة بالنسخ المتماثل. على وجه الخصوص، تخضع عمليات النسخ المتماثل للحمض النووي والعزل، على الأقل في جزء، وحسب المناطق الكروموسومات غير الترميز1، ووظيفة مناسبة لهذه المناطق يعتمد على السياق/موقع جينومي. في القولونية، هي أمثلة على الموقع التنمية المتكاملة للأسرة ، والمطلوبة للأخت كروموسوم القرار2؛ تسلسلات كوبس، المطلوبة ل العزل الصبغي3؛ ومن البيانات، DARS1، ومناطق DARS2 ، اللازمة لمراقبة النسخ المتماثل الصبغية السليم (أدناه؛ 4)-نقدم وسيلة تسمح بنقل عشوائي، واختيار، وتحديد سياق الجينية المثلى لأي عنصر من عناصر وراثية معينة، يتجلى هنا في دراسة المنطقة غير الترميز DARS2 .
في دنا كولاي، هو البادئ البروتين مسؤولة عن حبلا الحمض النووي فتح في النسخ المتماثل واحد المنشأ، أوريتش، وعن تجنيد هيليكاز دناب5،،من67. دنا ينتمي إلى AAA+ (أي، أتباسيس المرتبطة بأنشطة متنوعة) البروتينات ويمكن ربط ATP و ADP مع ارتفاع مماثل الانتماءات5. مستوى دناATP إلى الذروة في بدء8، حيث يشكل دناATP مولتيمير على أوريتش التي يطلق الحمض النووي الافتتاحية المزدوجة9. وبعد البدء، أوريتش غير متوفرة مؤقتاً لبدء إعادة سبب تنحية تقدمت إليه تشمل ربط البروتين سيكا إلى هيميميثيلاتيد أوريتش10،11. أثناء الحجز، يتم تخفيض مستوى دناATP بآليات اثنين على الأقل: المنظمة التنظيمية دنا (رضا)12،13 و البيانات-تعتمد دناATP التحلل المائي (دة)14 ،15. رضا وده تشجيع تحويل دناATP إلىADPدنا. قبل جولة جديدة من البدء، دناADP إعادة تنشيط دناATP في تسلسل إعادة تنشيط دنا معين (درس):16، DARS1 و DARS217. الصبغية البيانات، DARS1،DARS2 و المناطق هي غير الترميز وتتصرف بطريقة شبيهة بوصي تعدل دناATP/DnaAشرطة إينتيركونفيرسيون. هذه المناطق، يقع خارج أصل النسخ المتماثل، تمكين الجمعية دنا المعقدة أما المنظمة (بيانات؛ 14) أو التنشيط (DARS1 و DARS2؛ 17) من دنا. حذف DARS2 في زنزانة لا يغير جماعية مضاعفة الوقت ولكن النتائج في النسخ المتماثل غير متزامنة الشروع في15،،من1618. ومع ذلك، DARS2-تحتوي الخلايا قاصرة على اللياقة بدنية التكلفة مقارنة wildtype وأﻻ اسوي كلا المنافسة النمو المستمر في المتوسط غنية أو أثناء إقامة الاستعمار في الأمعاء الفأر18. وهذا يشير إلى أن تغييرات طفيفة حتى في تركيز أسينتشروني/الأصل له تأثير سلبي على اللياقة البدنية البكتيرية. كولاي، هناك ضغط انتقائي للحفاظ على التماثل (أي سنتين تقريبا متساوية الطول النسخ المتماثل الأسلحة) كروموسوم19. البيانات، و DARS1، ومناطق DARS2 بنفس المسافة النسبية أوريتش في جميع كولاي تسلسل السلالات18، على الرغم من الاختلافات الكبيرة في حجم الكروموسوم.
هنا، نحن استخدام منطقة DARS2 كولاي كمثال لتحديد المواقف صبغية أمثل لوظيفتها. تم إدراج DARS2 في ينقول نكبور، ونكبور الناتجة:: ينقولDARS2 بعد ذلك إدراج عشوائياً في جينوم MG1655 ΔDARS2. نحن وبالتالي إنشاء مجموعة من الخلايا، ووضع كل حيازة DARS2 في موقع مختلف على الكروموسوم. وأجرى في المختبر منافسة تجربة، حيث تجمع كافة الخلايا في جمع وتنافس ضد بعضها البعض من خلال النمو المستمر في رطل أجيال ما يقدر 700،. التجربة المنافسة تم رصد/تحديد النتائج استخدام الجنوب وصمة عار والمشي السهل الجينات وتسلسل الجينوم الجامع (WGS؛ الشكل 1). استنساخ نقطة النهاية حلها بالمشي الجينات سهلة اتسمت بالتدفق الخلوي لتقييم المعلمات دورة الخلية. في تحليل تدفق سيتوميتريك، ويمكن قياس حجم الخلية ومحتوى الحمض النووي وبدء التزامن لعدد كبير من الخلايا. أثناء التدفق الخلوي، تدفقا للخلايا المفردة يمر شعاع ضوء من الطول الموجي المناسب لإثارة الحمض الخلوي الصبغي الملون، ثم مسجلة من فوتومولتيبليرس التي تقوم بجمع الأسفار المنبعثة، مقياسا لمحتوى الحمض النووي، وفي وقت واحد شريطة خلايا ملطخة للحمض النووي. على ضوء متناثرة إلى الأمام مقياس للخلية الجماعية20.
ويستخدم في المختبر المنافسة التجربة نحن الحاضرين هنا لمعالجة المسائل المتصلة بأهمية الموقف الصبغية وسياق عنصر الوراثية الجينوم. الأسلوب غير متحيز وسهلة الاستخدام.
Protocol
Representative Results
Discussion
المنهجية المستخدمة هنا يستفيد من الدولة من أحدث التقنيات للإجابة على سؤال صعبة فيما يتعلق بموقف أحد العناصر الوراثية المجينية الأمثل. الإدراج عشوائي للعنصر الوراثي (توسط في ينقول) يتيح جمع سريعة وسهلة للآلاف من الحيوانات المستنسخة، التي ثم يمكن أن تتنافس ضد بعضها البعض لتحديد موضع العنص?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومولت المؤلفين المنح من مؤسسة نوفو نورديسك، ومؤسسة Lundbeck، ومؤسسة البحوث الوطنية الدانمركية (DNRF120) من خلال المركز “استجابة الضغط البكتيرية” واستمرار (يتصل).
Materials
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
- Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
- Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA Replication, Second Edition. , (1992).
- Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
- Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
- Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
- Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
- Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
- Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
- Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
- Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
- Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
- Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
- Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
- Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
- Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
- Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
- Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
- Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
- Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
- Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
- Harrison, R. W., Miller, J. C., D’Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
- Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
- Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
- Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
- Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
- Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
