Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde
Summary
Hier, werd de kracht van een transposon-gemedieerde willekeurige invoeging van een niet-coderende DNA element gebruikt om op te lossen zijn optimale chromosomale positie.
Abstract
De optimale chromosomale stand(en) van een bepaald DNA element was/waren vastbesloten door transposon-gemedieerde willekeurige opneming gevolgd door fitness selectie. Bij bacteriën kunnen de gevolgen van de genetische context op de functie van een genetische element moeilijk te beoordelen zijn. Verschillende mechanismen, met inbegrip van topologische effecten, transcriptionele storing door naburige genen, en/of Replicatie-geassocieerde gene dosering, kunnen invloed hebben op de functie van een bepaalde genetische element. Hier beschrijven we een methode waarmee de willekeurige integratie van een DNA-element in het chromosoom van Escherichia coli en selecteer de meest gunstige locaties met behulp van een eenvoudige groei competitie experimenteren. De methode maakt gebruik van een goed beschreven transposon gebaseerde systeem van willekeurige toevoeging, in combinatie met een selectie van de sterkste clone(s) door groei voordeel, een procedure die is gemakkelijk instelbaar tot experimentele behoeften. De aard van de sterkste clone(s) kan worden bepaald door geheel-genoom sequentiebepaling van een complexe multi klonale populatie of door eenvoudig gen lopen voor de snelle identificatie van geselecteerde klonen. Hier, werd de niet-coderende DNA regio DARS2, die controles van de inleiding van chromosoom replicatie in E. coli, gebruikt als een voorbeeld. De functie van DARS2 is bekend worden beïnvloed door replicatie-geassocieerde gene dosering; de dichter DARS2 krijgt naar de oorsprong van DNA replicatie, Hoe actiever wordt. DARS2 was willekeurig ingevoegd op het chromosoom van een DARS2-stam verwijderd. De resulterende klonen met individuele invoegingen werden gebundeld en streden tegen elkaar voor honderden generaties. Ten slotte waren de sterkste klonen gekenmerkt en blijken te bevatten DARS2 ingevoegd in de nabijheid van de locatie van de oorspronkelijke DARS2 .
Introduction
De functie van een genetische element kan worden beïnvloed door de locatie in het genoom. In bacteriën resulteert dit voornamelijk van inmenging door de transcriptie van naburige genen, de lokale DNA topologie, en/of de replicatie-geassocieerde gene dosering. In het bijzonder de processen van DNA-replicatie en segregatie worden gecontroleerd, ten minste gedeeltelijk, door niet-coderende chromosomale regio1, en de werking van deze regio’s hangt af van genomic locatie/context. In E.coli, voorbeelden zijn de dif -site, vereist voor zuster chromosoom resolutie2; KOPS sequenties, vereist voor3van de segregatie van chromosomen; en gegevens, DARS1en DARS2 regio’s, nodig zijn voor de controle van de juiste chromosomale replicatie (hieronder; 4). presenteren we een methode waardoor de willekeurige bedrijfsverplaatsingen, selectie en bepaling van de optimale genetische context van een bepaalde genetische element, hier wordt geïllustreerd door de studie van de DARS2 niet-coderende regio.
In E. coli, DnaA is de initiatiefnemer eiwit verantwoordelijk voor opening om de interne replicatie oorsprongoriCbundel van DNA, en voor de aanwerving van de helicase DnaB5,6,7. DnaA behoort tot de AAA+ (dat wil zeggen, ATPasen die is gekoppeld aan diverse activiteiten) eiwitten en zowel ATP en ADP kunt binden met een vergelijkbaar hoge affiniteiten5. Het niveau van DnaAATP pieken op inleiding8, waar DnaAATP vormt een multimer op oriC dat DNA dubbelzijdig opening9triggers. Na de inleiding, oriC tijdelijk niet beschikbaar voor opnieuw starten als gevolg van de sekwestratie is gemaakt door een mechanisme waarbij de binding van het eiwit SeqA te hemimethylated oriC10,11. Tijdens sekwester, het niveau van DnaAATP wordt verminderd met ten minste twee mechanismen: de regelgevende inactivering van DnaA (RIDA)12,13 en gegevens-afhankelijke DnaAATP hydrolyse (DDAH)14 ,15. Zowel RIDA en DDAH bevordering van de omschakeling van DnaAATP te DnaAADP. Voorafgaand aan een nieuwe ronde van inleiding, DnaAADP is opnieuw geactiveerd te DnaAATP op specifieke opeenvolgingen van het DnaA-reactiveren (DARS): DARS1 en DARS216,17. De chromosomale gegevens, DARS1,en DARS2 regio’s zijn niet-coderende en handelen op een chaperone-achtige wijze te moduleren DnaAATP/DnaAADP interconversion. Deze gebieden, gelegen buiten de oorsprong van replicatie inschakelen de vergadering van een complexe DnaA voor hetzij de inactivering (gegevens; 14) of activering (DARS1 en DARS2; 17) van DnaA. Verwijderen van DARS2 in een cel verandert niet massa verdubbeling tijd maar resultaten van asynchrone replicatie initiatie15,16,18. Echter DARS2-deficiënte cellen hebben een fitness kosten ten opzichte van een anders isogene wildtype tijdens de wedstrijd van beide continue groei in rijke medium of tijdens de totstandbrenging van kolonisatie van de darm van muis18. Dit geeft aan dat zelfs kleine veranderingen in de concentratie van de asynchrony/oorsprong een negatief effect hebben op bacteriële fitness. In E. coliis er een selectieve druk om het handhaven van chromosoom symmetrie (dat wil zeggen, twee bijna gelijke lengte replicatie arms)19. De gegevens, DARS1en DARS2 regio’s hebben de dezelfde relatieve afstand tot oriC in alle E. coli stammen sequenced18, ondanks de grote verschillen in de grootte van het chromosoom.
Hier, gebruiken we de DARS2 regio van E. coli als voorbeeld voor de identificatie van de chromosomale stand(en) optimaal functioneren. DARS2 werd ingevoegd in de NKBOR transposon, en de resulterende NKBOR::DARS2 transposon vervolgens willekeurig ingevoegd in het genoom van MG1655 ΔDARS2. Wij aldus opgewekte een verzameling cellen, elk bezit DARS2 geplaatst op een andere locatie op het chromosoom. Een in vitro competitie experiment, waar alle cellen in de collectie waren gebundeld en streden tegen elkaar tijdens de continue groei in LB voor een geschatte 700 generaties, werd uitgevoerd. De uitkomst van het experiment van de competitie werd gecontroleerd/bepaald met behulp van zuidelijke vlek gemakkelijk gene wandelen en geheel-genoom sequencing (WGS; Figuur 1). Eindpunt klonen opgelost door eenvoudig gene lopen werden gekenmerkt door stroom cytometry te evalueren van de celcyclus parameters. In een flow cytometrische analyse, kunnen celgrootte, DNA-inhoud en inleiding synchrony worden gemeten voor een groot aantal cellen. Tijdens stroom cytometry, loopt een stroom van afzonderlijke cellen een lichtstraal van de juiste golflengte te prikkelen de gebeitst DNA, die wordt vervolgens tegelijkertijd geregistreerd door photomultipliers die het verzamelen van de uitgestoten fluorescentie, een maatregel van DNA de inhoud, mits de cellen zijn gekleurd voor DNA. De forward-strooilicht is een maatregel van cel massa20.
De in vitro competitie experiment we hier presenteren wordt gebruikt om kwesties met betrekking tot het belang van de chromosomale positie en genomische context van de genetische element. De methode is onbevooroordeeld en makkelijk te gebruiken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gebruikte methode maakt gebruik van state-of-the-art technieken een moeilijke vraag met betrekking tot de optimale genomic positie van een genetische element te beantwoorden. De willekeurige invoeging van het genetische element (gemedieerd door de transposon) maakt het snel en gemakkelijk collectie van duizenden klonen, die vervolgens kunnen worden aangebracht om te concurreren tegen elkaar te selecteren voor de optimale positie van het onderzochte genetische element (d.w.z. de sterkste kloon).
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs werden gefinancierd door subsidies van de Novo Nordisk Foundation, de Stichting Lundbeck en de Deense nationale Research Foundation (DNRF120) door het centrum voor bacteriële stressrespons en persistentie (BASP).
Materials
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
- Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
- Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA Replication, Second Edition. , (1992).
- Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
- Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
- Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
- Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
- Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
- Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
- Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
- Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
- Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
- Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
- Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
- Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
- Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
- Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
- Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
- Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
- Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
- Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
- Harrison, R. W., Miller, J. C., D’Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
- Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
- Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
- Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
- Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
- Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
