Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz
Summary
Hier war die Macht der ein Transposon-vermittelten zufällige einführen eines nicht-kodierende DNA-Elements verwendet, um seine optimale chromosomalen Position zu lösen.
Abstract
Die optimale chromosomalen Position(en) eines bestimmten DNA-Elements war/waren bestimmt durch Transposon-vermittelten zufällige Einblendung gefolgt von Fitness-Auswahl. In Bakterien kann die Auswirkungen der genetischen Kontext auf die Funktion eines genetischen Elements schwer abzuschätzen sein. Mehrere Mechanismen, einschließlich topologische Effekte, transkriptionelle Interferenz von benachbarten Gene und/oder Replikation-assoziierten Gen Dosierung, können die Funktion eines bestimmten genetischen Elements beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Methode, die erlaubt die zufällige Integration eines DNA-Elements in das Chromosom von Escherichia coli und wählen Sie die günstigsten Standorten mit einem einfachen Wachstum Wettbewerb zu experimentieren. Die Methode nutzt eine gut beschriebene Transposon-basiertes System der zufällige Insertion, gepaart mit einer Auswahl an der stärkeren Clone(s) von Wachstum nutzen, ein Verfahren, das auf experimentelle Bedürfnisse leicht einstellbar ist. Die Art der fitteste Clone(s) kann durch ganze Genomsequenzierung auf eine komplexe Multi-klonale Population oder einfach zu Fuß für die schnelle Identifizierung von ausgewählten Klonen gen bestimmt werden. Hier war die nicht-kodierenden DNA-Region DARS2, die die Initiation der Replikation der Chromosomen in E. Colikontrolliert, als Beispiel verwendet. Die Funktion des DARS2 ist bekannt durch Replikation-assoziierten Gen Dosierung beeinträchtigt werden; der engere DARS2 ruft nach der Herkunft der DNA-Replikation, desto aktiver wird es. DARS2 wurde nach dem Zufallsprinzip in das Chromosom ein DARS2eingefügt-Belastung gelöscht. Die daraus resultierende Klone mit einzelnen Einfügungen wurden gebündelt und für Hunderte von Generationen gegeneinander konkurrierten. Schließlich wurden die fittesten Klone gekennzeichnet und festgestellt, dass DARS2 eingefügt in unmittelbarer Nähe zu den Originalschauplätzen der DARS2 enthalten.
Introduction
Durch seine Lage im Genom kann die Funktion eines genetischen Elements beeinträchtigt werden. In Bakterien ergibt sich somit vor allem vor Störungen durch die Transkription des benachbarten Gene, lokalen DNA Topologie und/oder Replikation-assoziierten Gen Dosierung. Insbesondere die Prozesse der DNA-Replikation und Segregation gesteuert werden, mindestens im Teil, durch nicht-kodierenden chromosomalen Regionen1und die ordnungsgemäße Funktion dieser Regionen hängt genomische Position/Kontext. In e. coli, Beispiele sind die Dif -Standort, erforderlich für Schwester Chromosom Auflösung2; KOPS-Sequenzen, erforderlich für Chromosom Abtrennung3; Daten, DARS1und DARS2 Regionen, für die ordnungsgemäße chromosomale Replikation Steuerung (unten; ( 4). präsentieren wir Ihnen eine Methode, für die zufällige Umzug, Auswahl und Bestimmung der optimalen genetischen Kontext eines bestimmten genetischen Elements, hier veranschaulicht durch das Studium der DARS2 nicht-kodierende Region.
In E. Coli, DnaA ist der Initiator Protein verantwortlich für DNA-Strang Eröffnung um einzelne Replikation HerkunftoriC, und für die Einstellung von der Helikase DnaB5,6,7. DnaA gehört zu den AAA+ (d. h. ATPasen verbunden mit vielfältigen Aktivitäten) Proteine und ATP und ADP zu binden mit ähnlich hohen Affinitäten5. Das Niveau der DnaAATP peaks bei Einleitung8, wo DnaAATP bildet ein Multimer auf oriC auslöst, die DNA duplex Öffnung9. Nach der Einleitung oriC erfolgt durch einen Mechanismus mit der Bindung des Proteins SeqA Hemimethylated vorübergehend nicht verfügbar für Wiederaufnahme wegen Sequestrierung oriC10,11. Während der Sequestrierung, sinkt das Niveau der DnaAATP durch mindestens zwei Mechanismen: die regulatorischen Inaktivierung der DnaA (RIDA)12,13 und Daten-abhängige DnaAATP Hydrolyse (Gefässwiderstand)14 ,15. RIDA und Gefässwiderstand fördern die Umwandlung von DnaAATP zuADPDnaA. Vor einer neuen Runde der Initiation, DnaAADP wird wieder aktiviert, DnaAATP bei bestimmten DnaA-Reaktivierung Sequenzen (DARS): DARS1 und DARS216,17. Die chromosomalen Daten, DARS1und DARS2 Regionen sind nicht-kodierende und Handeln in einem Chaperon-Manier zu modulieren, DnaAATP/DnaAADP fußenden. Diese Regionen außerhalb der Ursprung der Replikation, ermöglichen der Montage von einem komplexen DnaA für entweder die Inaktivierung (Daten, 14) oder Aktivierung (DARS1 und DARS2; 17) der DnaA. DARS2 in einer Zelle löschen, ändert nicht Masse Verdoppelung Zeit aber Ergebnisse asynchroner Replikation Einleitung15,16,18. Jedoch DARS2-mangelhafte Zellen haben eine Fitness Kosten im Vergleich zu einer ansonsten isogenen Wildtyp, während beide kontinuierliches Wachstum Wettbewerb im Reich Medium oder die Einrichtung der Besiedlung im Darm Maus18. Dies bedeutet, dass bereits geringe Veränderungen Asynchronie/Herkunft Konzentration wirkt sich negativ auf die bakterielle Fitness haben. In E. Coligibt es einen Selektionsdruck auf Chromosom Symmetrie (d. h. zwei fast gleich lang Replikation Arme)19pflegen. Daten, DARS1und DARS2 Regionen haben den gleichen relativen Abstand zu oriC in alle E. Coli Stämme18, trotz großen Schwankungen in der Größe von Chromosom sequenziert.
Hier verwenden wir die DARS2 Region von E. Coli als Beispiel für die Identifizierung von der chromosomalen Position(en) optimal für seine Funktion. DARS2 wurde in das Transposon NKBOR und die daraus resultierende NKBOR eingefügt::DARS2 Transposon anschließend nach dem Zufallsprinzip eingefügt in das Genom der MG1655 ΔDARS2. Wir erzeugt somit eine Ansammlung von Zellen, jede besitzen DARS2 platziert an einem anderen Ort auf dem Chromosom. Ein in-vitro- Wettbewerb Experiment, wo alle Zellen in der Auflistung wurden gebündelt und während des kontinuierlichen Wachstums in LB für eine geschätzte 700 Generationen gegeneinander angetreten, wurde durchgeführt. Das Ergebnis des Experiments Wettbewerb wurde überwacht/ermittelt mithilfe von südlicher Fleck, leicht gen zu Fuß und Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS; ( Abbildung 1). Endpunkt-Klone zu Fuss leicht gen gelöst waren gekennzeichnet durch Durchflusszytometrie, Zellzyklus Parameter zu bewerten. In einer durchflusszytometrischen Analyse können die Zellengröße, DNA-Gehalt und Einleitung Synchronität für eine große Anzahl von Zellen gemessen werden. Während der Durchflusszytometrie, ein Strom von Einzelzellen übergibt einen Lichtstrahl der entsprechenden Wellenlänge die gefärbte DNA begeistern die dann gleichzeitig durch Photomultiplier, die sammeln die emittierte Fluoreszenz, ein gewisses Maß an DNA-Gehalt, registriert ist sofern die Zellen sind für DNA gefärbt. Das vorwärts-verstreut Licht ist ein Maß für die Zelle Masse20.
Die in-vitro- Wettbewerb Experiment, das wir hier vorstellen wird verwendet, um Fragen in Bezug auf die Bedeutung der chromosomalen Position und genomische Kontext des genetischen Elements. Die Methode ist neutral und einfach zu bedienen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier verwendete Methodik nutzt State-of-the-Art Techniken, eine schwierige Frage in Bezug auf die optimale genomische Position eines genetischen Elements zu beantworten. Die zufällige Aufnahme des genetischen Elements (vermittelt durch das Transposon) ermöglicht die schnelle und einfache Sammlung von Tausenden von Klone, die dann vorgenommen werden kann, wählen für die optimale Position des untersuchten genetischen Elements gegeneinander antreten (d.h. der fitteste Klon).
Hier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren wurden durch Zuschüsse aus der Novo Nordisk Stiftung, die Lundbeck-Stiftung und der dänischen National Research Foundation (DNRF120) durch das Zentrum für bakterielle Stressantwort und Persistenz (BASP) finanziert.
Materials
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
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