. כאן, עוצמת הכניסה אקראי בתיווך transposon של רכיב ה-DNA ללא קידוד שימש כדי לפתור את מעמדה כרומוזומלית אופטימלית.
Position(s) כרומוזומליות אופטימלית של רכיב ה-DNA נתון היה/נקבעו על ידי הכניסה אקראי בתיווך transposon ואחריו כושר בחירה. בחיידקים, ההשפעה של הקשר הגנטי על הפונקציה של רכיב גנטי יכול להיות קשה להעריך. מספר מנגנונים, כולל אפקטים טופולוגי, מהפרעות תעתיק של גנים השכן, ו/או הקשורים שכפול גנטי המינון, עלול להשפיע על הפונקציה של רכיב גנטי נתון. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת שילוב אקראי של רכיב ה-DNA לתוך הכרומוזום של Escherichia coli , בחר המיקומים מאהדה ביותר באמצעות תחרות גדילה פשוטה להתנסות. השיטה מנצלת מערכת מבוססת transposon היטב תיאר של הכניסה אקראי, יחד עם מבחר clone(s) ביותר על ידי צמיחה יתרון, הליך ניתנת להתאמה בקלות לצרכים ניסיוני. מהות clone(s) בכושר יכול להיקבע על ידי רצף הגנום כולו על אוכלוסיה מרובת המשובטים מורכבים או ג’ין קל של זיהוי מהיר של שיבוטים שנבחרו. כאן, באזור ה-DNA ללא קידוד DARS2, השולטת אתחול של הכרומוזום ב e. coli, שימש כדוגמה. הפונקציה של DARS2 ידוע להיות מושפעות המינון הקשורים שכפול גנטי; קרובה יותר DARS2 על מוצאם של שכפול ה-DNA, פעיל יותר זה נעשה. DARS2 הוכנס באופן אקראי לתוך הכרומוזום של DARS2-נמחק זן. שיבוטים הנובעת המכילה הוספות בודדים היו איחדו, התחרו אחד נגד השני במשך מאות דורות. לבסוף שיבוטים בכושר היו מאופיין, יתחוור DARS2 מוכנס בסמיכות למיקום DARS2 המקורי.
הפונקציה של כל רכיב גנטי עשויה להיות מושפעת מיקומו הגנום. בחיידקים, זה בעיקר נובע הפרעה על ידי שעתוק של גנים השכן, טופולוגיה DNA מקומיים, ו/או הקשורים שכפול גנטי המינון. בפרט, תהליכי שכפול ה-DNA, סגרגציה נשלטים, לפחות בחלקו, לפי אזורים כרומוזומלית ללא קידוד1ו לתפקוד תקין של אזורים אלה תלוי מיקום גנומית/הקשר. ב- e. coli, דוגמאות באתר dif , הדרושים עבור אחותי ברזולוציה של כרומוזום2; רצפים KOPS, נדרש כרומוזום סגרגציה3; ואת הנתונים, DARS1ואזורי DARS2 , הנדרשים לשליטה נכונה הכרומוזום (להלן; 4). אנו מציגים שיטה ומאפשר רילוקיישן אקראי, בחירה ונחישות של הקשר הגנטי אופטימלית של כל רכיב גנטי מסוים, כאן כשניסחתי חקר האזור ללא קידוד DARS2 .
ב- e. coli, DnaA הוא החלבון יוזם ממונה על צירוף ד. נ פתיחת שכפול יחיד מוצאoriC, ועל הגיוס של הליקאז DnaB5,6,7. DnaA שייך AAA+ (קרי, ATPases הקשורים עם פעילויות מגוונות) חלבונים יכולים לאגד הן ATP ו ADP עם גבוה דומה הזיקות5. הרמה של DnaAATP פסגות-חניכה8, איפה DnaAATP מתפתח multimer על oriC , זה מעורר דנ א דופלקס פתיחה9. לאחר החניכה, oriC עשוי אינו זמין באופן זמני עבור אתחול מחדש עקב פחמיות באמצעות מנגנון המערבים את הכריכה של החלבון SeqA כדי hemimethylated oriC10,11. במהלך פחמיות, הרמה של DnaAATP הוא מופחת על ידי לפחות שני מנגנונים: איון הרגולציה של 12,DnaA (רידא)13 ונתונים-תלוי DnaAATP הידרוליזה (DDAH)14 ,15. רידא והן DDAH לקדם את ההמרה של DnaAATP DnaAADP. לפני סבב חדש של חניכה, DnaAADP הוא מופעל מחדש כדי DnaAATP -רצפים ספציפיים הפעלה מחדש-של DnaA (DARS):16, DARS1 ו- DARS217. כרומוזומלית נתונים, DARS1, וDARS2 הם ללא קידוד ולהתנהג בצורה דמוית המלווה כדי לווסת את DnaAATP/DnaAADP interconversion. אזורים אלה, הממוקם מחוץ המקור של שכפול, לאפשר ההרכבה של DnaA מורכבים גם איון (נתונים; 14) או ההפעלה (DARS1 , DARS2; 17) של DnaA. מחיקת DARS2 בתא אינו משנה זמן ההכפלה המוני, אך יוצרת שכפול אסינכרוני חניכה15,16,18. עם זאת, DARS2-הלקוי ולתאים יש כושר בהשוואה wildtype isogenic אחרת במהלך שני תחרות צמיחה מתמשכת במדיום עשיר או במהלך הקמת מושבת המעי העכבר18. אפשרות זו מציינת כי שינויים קלים אפילו בריכוז asynchrony/מקור יש השפעה שלילית על כושר חיידקי. E. coli, יש לחץ סלקטיבי כדי לשמור על סימטריה (קרי, שני אורך כמעט שווה שכפול נשק) כרומוזום19. הנתונים, DARS1ואזורי DARS2 יש את המרחק היחסי באותו oriC בתוך כל e. coli זנים וסודרו18, למרות וריאציות גדול בגודל כרומוזום.
כאן, אנו משתמשים האזור DARS2 של e. coli כדוגמה לצורך זיהוי position(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור תפקידה. DARS2 הוכנס לתוך transposon את NKBOR, את NKBOR תוצאות:: transposonDARS2 לאחר מכן מוכנס באופן אקראי לתוך הגנום של MG1655 ΔDARS2. לכן יצרנו אוסף של תאים, פו-טי כל DARS2 להציב במקום אחר על כרומוזום ה. במבחנה תחרות ניסוי, בו כל התאים באוסף היו איחדו, התחרו אחד נגד השני במהלך צמיחה מתמשכת ב- LB דורות 700 מוערך, בוצעה. תוצאת הניסוי תחרות פיקוח/נקבע באמצעות תספיג דנ א, ג’ין קל הליכה רצף הגנום כולו (WGS; איור 1). שיבוטים מובילים נפתרה על ידי ג’ין קל הליכה התאפיינו cytometry זרימה כדי להעריך את מחזור התא בפרמטרים. בניתוח cytometric זרימה, ניתן למדוד גודל תא, תוכן ה-DNA, חניכה synchrony עבור מספר גדול של תאים. במהלך cytometry זרימה, עובר זרם של תאים בודדים קרן אור של הגל המתאים כדי לרגש מוכתם הדנ א, אשר לאחר מכן נרשם בו זמנית על-ידי photomultipliers אוספים את הנפלט פלורסצנטיות, מידה של תוכן ה-DNA, בתנאי תאים מוכתמים לדנ א. האור מפוזר-קדימה הוא מדד של המוני תאים20.
במבחנה תחרות הניסוי שאנו מציגים כאן משמש כדי לטפל בשאלות המתייחסות חשיבות המיקום כרומוזומליות ואת ההקשר גנומית של רכיב גנטי. השיטה זו לא משוחד, קל לשימוש.
המתודולוגיה בשימוש כאן מנצל המדינה-of-the-art טכניקות כדי לענות על שאלה קשה בנוגע המיקום האופטימלי גנומית של רכיב גנטי. הכניסה אקראי של הרכיב הגנטי (בתיווכו של transposon) מאפשר את האוסף קלה ומהירה של אלפי שיבוטים, אשר לאחר מכן ניתן יהיה לעשות מתחרות זו בזו כדי לבחור את המיקום האופטימלי של הרכיב הגנ?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים היו במימון מלגות קרן נובו נורדיסק, קרן לונדבק, דנית מחקר הקרן הלאומית (DNRF120) דרך המרכז תגובת המתח חיידקי, התמדה (BASP).
Autoclaved Mili-Q water | None | ||
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
Chloroform | Merck | 2445 | |
Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
Apogee A10 instrument | Apogee |