Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход
Summary
Здесь мощность transposon опосредованной случайные вставки элемента-кодирования ДНК использовался для разрешения его оптимального хромосомные положения.
Abstract
Оптимальной хромосомных позиции данного элемента ДНК была/были определены transposon опосредованной случайные вставки после отбора фитнес. В бактерии влияние генетических контекста на функции генетического элемента может быть трудно оценить. Ряд механизмов, включая топологических эффекты, транскрипционный анализ помехи от соседних генов, и/или репликации связанных генов дозировки, может повлиять на функции данного генетического элемента. Здесь мы описываем метод, который позволяет случайных интеграции элемента ДНК в хромосоме Escherichia coli и выберите наиболее благоприятных мест, с помощью простого роста конкуренции эксперимент. Этот метод принимает преимущество хорошо описано на базе transposon системы случайные вставки, в сочетании с выбором приспособленных clone(s) роста преимущество, процедура, которая легко регулируются для экспериментальной потребности. Характер приспособленных clone(s) может определяться всего генома на сложных мульти клоновых населения или легко гена, ходьба для быстрой идентификации отдельных клонов. Здесь без кодирования ДНК региона DARS2, которая контролирует инициации репликации хромосомы в E. coli, был использован в качестве примера. Функция DARS2 , как известно, быть затронуты дозировка репликации связанных генов; ближе DARS2 получает происхождения репликации ДНК, тем более активной становится. DARS2 случайно был вставлен в хромосоме DARS2-исключить деформации. Результирующая клоны, содержащие отдельные вставки были объединены и соревновались друг с другом для сотни поколений. Наконец приспособленных клоны были характерны и содержит DARS2 вставлены в непосредственной близости от первоначального места DARS2 .
Introduction
Функцию любого генетического элемента могут быть затронуты его расположение в геноме. В бактерии это главным образом результатом вмешательства по транскрипции соседних генов, местные ДНК топологии или репликации связанных генов дозировка. В частности процесс репликации ДНК и сегрегации находятся под контролем, по крайней мере в части, некодирующих хромосомных регионов1и правильного функционирования этих регионов зависит геномной местоположение/контекста. В E.coli, примерами являются сайт НСВРС , необходимые для сестра хромосомы резолюции2; КОПС последовательности, необходимые для хромосома сегрегации3; данных, DARS1и DARS2 регионов, требуется для надлежащей репликации хромосомных управления (ниже; 4). Мы представляем метод, позволяющий для случайного перемещения, выбора и определения оптимального генетических контекста любого данного генетического элемента, здесь свидетельствует исследование некодирующих региона DARS2 .
В E. coli, DnaA отвечает инициатор белка для открытия на одной репликации происхожденияОричстренге дна и для найма helicase DnaB5,6,7. DnaA принадлежит к AAA+ (т.е., ATPases, связанные с различными мероприятиями) белки и можно привязать АТФ и АДФ с аналогичными высокой работоспособностью5. УровеньАТФ DnaA пики на начало8, где DnaAСПС образует multimer на Орич что вызывает ДНК дуплекс открытия9. После посвящения Орич производится механизм связывания белка SeqA, чтобы hemimethylated временно недоступен для повторного запуска из-за поглощения Орич10,11. Во время связывания, уровень DnaAАТФ снижается, по крайней мере два механизма: регулирования инактивации DnaA (RIDA)12,13 и данных-зависимых DnaAСПС гидролиз (DDAH)14 ,15. Рида и DDAH способствуют преобразование DnaAСПС DnaAADP. До нового раунда посвящения, DnaAADP повторную активацию с DnaAАТФ в специфических последовательностей реактивации DnaA (DARS): DARS1 и DARS216,17. Хромосомная данных, DARS1и DARS2 регионах некодирующих и действовать шаперонов как для модуляции DnaAАТФ/DnaAADP взаимное преобразование. Эти районы, расположенные за пределами происхождения репликации, чтобы Ассамблея DnaA комплекс либо инактивация (данные; 14) или активации (DARS1 и DARS2; 17) из DnaA. Удаление DARS2 в клетке не меняет массы удвоение время, но результаты асинхронной репликации начало15,16,18. Однако DARS2-дефицит клетки имеют фитнес стоимость по сравнению с иначе isogenic wildtype во время обоих непрерывного роста конкуренции в богатой среде или создания колонизации кишечника мыши18. Это означает, что даже незначительные изменения в концентрации асинхронности/происхождения имеют негативное воздействие на бактериальных фитнес. В E. coliсуществует селективного давления для поддержания хромосома симметрии (т.е. два почти одинаковой длины оружия репликации)19. Данных, DARS1и DARS2 регионы имеют же относительное расстояние до Орич всех E. coli штаммов виртуализированных18, несмотря на большие различия в размер хромосомы.
Здесь мы используем DARS2 региона кишечной палочки в качестве примера для выявления хромосомных положении(ях), оптимальный для его функции. DARS2 был вставлен в NKBOR transposon и результирующая NKBOR::DARS2 transposon, впоследствии вставлены случайно в геном MG1655 ΔDARS2. Таким образом, мы создали коллекцию ячеек, каждый обладающий DARS2 размещены в другом месте на хромосоме. В vitro конкуренции эксперимент, где все клетки в коллекции были объединены и соревновались друг с другом во время непрерывного роста в LB для примерно 700 поколений, была выполнена. Итоги конкурса эксперимента мониторинг/определялся с помощью Южная помарка, легко гена ходьбу и всего генома (РГ; Рисунок 1). Концевой клоны, решаются ходьба легко гена характеризовались проточной цитометрии для оценки параметров клеточного цикла. В анализе гранулярных потока размер ячейки, содержание ДНК и инициации синхронии может измеряться для большого числа клеток. При проточной цитометрии, поток одиночных клеток проходит луч света соответствующей длины волны для возбуждения окрашенных ДНК, которая затем одновременно зарегистрирована в photomultipliers, которые собирают испускаемого флуоресценции, мера содержания ДНК, условии клетки витражи для ДНК. Рассеянном свете является мерой массы клеток20.
В vitro конкуренции эксперимент, который мы представляем здесь используется для решения вопросов, касающихся важности хромосомных позиции и геномных контексте генетического элемента. Метод объективной и легко в использовании.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методология, используемая здесь преимущества методов ответить трудный вопрос относительно оптимального геномной положение генетического элемента. Случайные вставки генетического элемента, (при посредничестве transposon) позволяет быстро и легко коллекция из тысяч клонов, которые затем ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы были финансируемых за счет грантов из Ново Нордиск фонд, Фонд Lundbeck и датский национальный исследовательский фонд (DNRF120) через центр для бактериальных реакции на стресс и настойчивость (BASP).
Materials
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
- Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
- Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA Replication, Second Edition. , (1992).
- Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
- Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
- Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
- Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
- Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
- Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
- Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
- Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
- Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
- Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
- Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
- Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
- Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
- Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
- Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
- Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
- Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
- Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
- Harrison, R. W., Miller, J. C., D’Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
- Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
- Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
- Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
- Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
- Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
