Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

A função de qualquer elemento genético pode ser afetada pela sua localização no genoma. Em bactérias, isto principalmente resulta da interferência pela transcrição dos genes vizinhos, topologia de DNA local, e/ou dosagem de gene associada a replicação. Em particular, os processos de replicação de DNA e segregação são controlados, pelo menos em parte, pelas regiões cromossômicas não-codificantes¹e o funcionamento destas regiões depende de localização/contexto genômico. Em e. coli, exemplos são o site dif , necessário para a irmã de resolução do cromossomo²; Sequências KOPS, necessárias para segregação de cromossomo³; e dados, DARS1e DARS2 regiões, necessárias para o controle adequado de replicação cromossômica (abaixo; ⁴). apresentamos um método permitindo a realocação aleatória, seleção e determinação do contexto genético ideal de qualquer elemento genético determinado, exemplificado aqui o estudo da região não-codificante DARS2 .

Em e. coli, DnaA é a proteína de iniciador responsável pela cadeia de DNA, abrindo a única replicação origemoriquee para o recrutamento do helicase DnaB^5,6,7. DnaA pertence a AAA⁺ (i.e., ATPase associados com diversas atividades) proteínas e pode vincular tanto ATP e ADP com alta semelhante afinidades⁵. O nível de DnaA^ATP picos no início⁸, onde DnaA^ATP forma um multimer na orique que aciona o DNA abertura frente e verso⁹. Após a iniciação, orique feita temporariamente indisponível para re-iniciação devido ao sequestro por um mecanismo que envolve a ligação da proteína SeqA a hemimethylated orique^10,11. Durante o sequestro, o nível de DnaA^ATP é reduzido pelo menos dois mecanismos: a inactivação regulamentar de DnaA (RIDA)^12,13 e dados-dependente DnaA^ATP hidrólise (DDAH)^{14 ,15}. Tanto RIDA e DDAH promovem a conversão de DnaA^ATP DnaA^ADP. Antes de uma nova rodada de iniciação, DnaA^ADP é re-ativado para DnaA^ATP em sequências específicas de DnaA-reativando (DARS): DARS1 e DARS2^16,17. Os cromossomas dados, DARS1, regiõese DARS2 são não-codificantes e agir em uma maneira semelhante ao acompanhante para modular DnaA^ATP/DnaA^ADP interconversão. Nestas regiões, localizadas fora a origem de replicação, permitem a montagem de um complexo de DnaA para qualquer a inactivação (dados; ¹⁴) ou ativação (DARS1 e DARS2; ¹⁷) de DnaA. Exclusão de DARS2 em uma célula não altera massa dobrando tempo mas resultados em replicação assíncrona iniciação^15,16,18. No entanto, DARS2-células deficientes têm uma aptidão custo comparado a uma sua outra forma isogénicas durante ambas as competição de contínuo crescimento em meio rico, ou durante o estabelecimento da colonização do intestino de rato¹⁸. Isso indica que mesmo pequenas alterações na concentração de assincronia/origem tem um efeito negativo na aptidão bacteriana. Em e. coli, há uma pressão seletiva para manter a simetria (ou seja, dois braços de replicação de comprimento quase igual) de cromossomo¹⁹. Os dados, DARS1e DARS2 regiões têm a mesma distância relativa à orique em todas as e. coli estirpes sequenciadas¹⁸, apesar das grandes variações no tamanho do cromossoma.

Aqui, usamos a região de DARS2 de e. coli como exemplo para a identificação da posição cromossômica ideal para sua função. DARS2 foi inserido o transposon NKBOR e o resultante NKBOR::DARS2 transposon posteriormente inserido aleatoriamente no genoma de MG1655 ΔDARS2. Assim, geramos uma coleção de células, cada possuidor DARS2 colocados em um local diferente no cromossomo. Em vitro concorrência experimento, onde todas as células na coleção foram agrupadas e competiam entre si durante o crescimento contínuo em LB para um número estimado de 700 gerações, foi realizado. O resultado da experiência de competição foi monitorado/determinado usando o Southern blot, gene fácil caminhar e sequenciamento do genoma inteiro (WGS; A Figura 1). Clones de ponto de extremidade, resolvidos por gene fácil andar foram caracterizados por citometria de fluxo para avaliar parâmetros do ciclo celular. Em uma análise de fluxo cytometric, tamanho da célula, conteúdo de DNA e sincronia de iniciação podem ser medidos por um grande número de células. Durante citometria de fluxo, um fluxo de células únicas passa um feixe de luz de comprimento de onda apropriado para excitar o DNA manchado, então simultaneamente registado por photomultipliers que coletam a fluorescência emitida, uma medida do conteúdo de DNA, desde o as células são coradas para DNA. A luz difusa é uma medida da massa de célula²⁰.

O experimento concorrência em vitro que apresentamos aqui é usado para abordar questões relacionadas com a importância da posição cromossômica e contexto genômico do elemento genético. O método é imparcial e fácil de usar.