Détermination de l’emplacement chromosomique optimale pour un élément d’ADN chez Escherichia coli en utilisant une nouvelle approche induite par le Transposon

La fonction de tout élément génétique peut être affectée par son emplacement dans le génome. Chez les bactéries, cela s’explique principalement par l’interférence de la transcription des gènes voisins, topologie de l’ADN local et/ou dosage des gènes associés à la réplication. En particulier, les processus de réplication de l’ADN et la ségrégation sont contrôlés, au moins en partie, par les régions chromosomiques non codantes¹et le bon fonctionnement de ces régions dépend de génomique emplacement/contexte. Dans e. coli, on peut citer le site dif , requis pour la soeur du chromosome résolution²; Séquences KOPS, nécessaires à la ségrégation des chromosomes³; et données, DARS1et régions DARS2 , requises pour le contrôle de la bonne réplication chromosomique (ci-après ; ⁴). nous présentons une méthode permettant le déplacement aléatoire, la sélection et la détermination du contexte génétique optimal de n’importe quel élément génétique donné, illustrée ici par l’étude de la région non codante de DARS2 .

Dans e. coli, DnaA est la protéine initiateur responsable de brin d’ADN à l’origine de réplication uniqueoriCd’ouverture et de recrutement de l’hélicase DnaB^5,6,7. DnaA appartient à l’AAA⁺ (c.-à-d., ATPases associée à diverses activités) protéines et peuvent lier les ATP et l’ADP avec haute similaire affinités⁵. Le niveau de DnaA^ATP culmine à initiation⁸, où DnaA^ATP forme un polymère sur oriC qui déclenche l’ADN duplex ouverture⁹. Après l’initiation, oriC est fait temporairement indisponible pour la reprise en raison de la séquestration par un mécanisme impliquant la liaison de la protéine de SeqA à hemimethylated oriC^10,11. Au cours de la séquestration, le niveau de DnaA^ATP est réduit par au moins deux mécanismes : l’inactivation réglementaire de DnaA (RIDA)^12,13 et données-dépendant DnaA^ATP hydrolyse (DDAH)^{14 ,},¹⁵. RIDA tant DDAH promouvoir la reconversion de DnaA^ATP à DnaA^ADP. Avant un nouveau cycle d’initiation, DnaA^ADP est réactivé à DnaA^ATP à des séquences spécifiques DnaA-réactivation (DARS) : DARS1 et DARS2^16,17. Les chromosomiques données, DARS1, régionset DARS2 sont non codantes et agir dans la manière d’un chaperon pour moduler DnaA^ATP/DnaA^ADP interconversion. Ces régions, situées en dehors de l’origine de réplication, permettent à l’Assemblée d’un complexe de DnaA pour soit l’inactivation (données: ¹⁴) ou activation (DARS1 et DARS2; ¹⁷) de DnaA. Suppression DARS2 dans une cellule ne modifie pas la masse doublement temps mais entraîne une réplication asynchrone initiation^15,16,18. Toutefois, DARS2-cellules déficientes ont une adéquation coût par rapport à un type sauvage isogénique sinon les deux concours de croissance continue en milieu riche ou pendant la mise en place de la colonisation dans l’ intestin de souris¹⁸. Cela signifie que même mineures variations de concentration de l’asynchronisme/origine ont un effet négatif sur la forme bactérienne. Chez e. coli, il y a une pression sélective pour maintenir de symétrie (c.-à-d., deux armes de réplication de longueur presque égale) du chromosome¹⁹. Les données, les DARS1et les régions DARS2 ont la même distance relative à oriC dans tous les e. coli souches séquencé¹⁸, malgré des variations importantes de dimension des chromosomes.

Ici, nous utilisons la région DARS2 d’e. coli à titre d’exemple pour l’identification de l’ou les positions chromosomique optimale pour sa fonction. DARS2 a été insérée dans le transposon NKBOR et la NKBOR qui en résulte :: transposonDARS2 subséquemment inséré au hasard dans le génome de MG1655 ΔDARS2. Ainsi, nous avons généré une collection de cellules, chaque possession DARS2 placé à un emplacement différent sur le chromosome. In vitro compétition expérimental, où toutes les cellules de la collection ont été mis en commun et a concouru contre l’autre au cours de la croissance continue pour un estimé générations 700 LB, a été réalisée. Le résultat de l’expérience de la compétition a été surveillé/déterminée par Southern blot, gène simple marche et le séquençage du génome entier (groupes de travail ; La figure 1). Clones de point final résolus par la simple gène marche ont été caractérisés par cytométrie de flux pour évaluer les paramètres du cycle cellulaire. Dans une analyse de cytométrie en flux, la taille des cellules, la teneur en ADN et synchronie initiation peuvent être mesurées pour un grand nombre de cellules. Au cours de la cytométrie en flux, un flux des cellules simples passe un faisceau lumineux de la longueur d’onde appropriée pour exciter l’ADN tachée, qui est ensuite simultanément enregistré par Photomultiplier qui recueillent la fluorescence émise, une mesure du contenu en ADN, autant la les cellules sont colorées pour l’ADN. La lumière diffusée vers l’avant est une mesure de la masse cellulaire²⁰.

L’expérience compétition in vitro que nous présentons ici est utilisé pour traiter les questions relatives à l’importance de la position chromosomique et contexte génomique de l’élément génétique. La méthode est facile à utiliser et impartiale.