Qui, il potere di un’inserzione casuale transposon-mediata di un elemento di DNA non codificante è stato usato per risolvere la sua ottimale posizione cromosomica.
Le posizioni cromosomiche ottimale di un dato elemento di DNA è stato/sono state determinate mediante inserimento casuale transposon-mediata seguita dalla selezione di fitness. Nei batteri, l’impatto del contesto genetico sulla funzione di un elemento genetico può essere difficile da valutare. Parecchi meccanismi, compreso gli effetti topologici, interferenza trascrizionale da geni vicini, e/o dosaggio genico replica-collegato, possono influenzare la funzione di un dato elemento genetico. Qui, descriviamo un metodo che consente l’integrazione casuale di un elemento di DNA nel cromosoma di Escherichia coli e selezionare le posizioni più favorevoli utilizzando una concorrenza crescita semplice esperimento. Il metodo si avvale di un sistema basato su trasposone ben descritto di inserimento casuale, accompagnato da una selezione del clone(s) più adatto nel vantaggio di crescita, una procedura che è facilmente regolabile per esigenze sperimentali. La natura del clone(s) più adatto può essere determinata mediante sequenziamento intero genoma su una popolazione multi-clonale complesso o dal gene facile a piedi per la rapida identificazione di cloni selezionati. Qui, la regione di DNA non codificante DARS2, che controlla l’avvio della replica del cromosoma in e. coli, è stata usata come esempio. La funzione di DARS2 è noti per essere interessati da dosaggio genico replica-collegato; il più vicino DARS2 Ottiene l’origine di replicazione del DNA, diventa più attivo. DARS2 casualmente è stato inserito nel cromosoma di un DARS2-eliminato il ceppo. I cloni risultanti contenente singoli inserimenti sono stati riuniti ed ha gareggiati uno contro l’altro per centinaia di generazioni. Infine, i cloni più adatti sono stati caratterizzati e trovati per contenere DARS2 inserita nella prossimità vicina alla posizione originale di DARS2 .
La funzione di qualsiasi elemento genetico può essere influenzata dalla sua posizione nel genoma. Nei batteri, questo dipende principalmente da interferenze dalla trascrizione di geni vicini, topologia del DNA locale e/o dosaggio genico replica-collegata. In particolare, i processi di replicazione del DNA e di segregazione sono controllati, almeno in parte, di regioni cromosomiche non codificanti1e la funzione di queste regioni dipende dalla posizione/contesto genomico. In e. coli, gli esempi sono il sito di dif , necessario per la sorella del cromosoma risoluzione2; Sequenze KOPS, richiesti per di segregazione del cromosoma3; dati, DARS1e regioni DARS2 , necessarie per il controllo della corretta replica cromosomica (sotto; 4). vi presentiamo un metodo che consente il trasferimento casuale, selezione e determinazione del contesto genetico ottimo di ogni singolo elemento genetico, esemplificato qui dallo studio della regione non codificante DARS2 .
In e. coli, DnaA è la proteina di iniziatore responsabile filo del DNA di apertura presso la replica singola origineoriCe per l’assunzione di elicasi DnaB5,6,7. DnaA appartiene alla AAA+ (cioè, ATPasi associata con attività diverse) proteine e può legare ATP e ADP con simile ad alta affinità5. Il livello di DnaAATP picchi a iniziazione8, dove DnaAATP forma un multimer su oriC che innesca il DNA duplex apertura9. Dopo l’inizio, oriC fatta temporaneamente non disponibile per riattivazione a causa del sequestro di un meccanismo che coinvolge l’associazione della proteina SeqA per hemimethylated oriC10,11. Durante il sequestro, il livello di DnaAATP è ridotto di almeno due meccanismi: l’inattivazione normativo di DnaA (RIDA)12,13 e dati-dipendente DnaAATP idrolisi (DDAH)14 ,15. RIDA sia DDAH promuovere la conversione di DnaAATP a DnaAADP. Prima di un nuovo ciclo di iniziazione, DnaAADP è riattivato per DnaAATP alle sequenze specifiche di riattivazione di DnaA (DARS): DARS1 e DARS216,17. Cromosomiche dati, DARS1, regionie DARS2 sono non-codificazione e agire in un modo tipo di chaperon per modulare DnaAATPl’interconversione diADP di /DnaA. Queste regioni, che si trova di fuori l’origine di replicazione, consentono il montaggio di un complesso di DnaA per entrambi l’inattivazione (dati; 14) o l’attivazione (DARS1 e DARS2; 17) di DnaA. L’eliminazione di DARS2 in una cella non altera massa raddoppio tempo ma risultati in replica asincrona iniziazione15,16,18. Tuttavia, DARS2-cellule carenti hanno una palestra costo rispetto ad un altrimenti isogeniche wildtype durante sia concorso di continua crescita in mezzo ricco o durante l’istituzione della colonizzazione dell’intestino del mouse18. Ciò indica che anche i più piccoli cambiamenti nella concentrazione di asincronia/origine hanno un effetto negativo sul fitness batterica. In e. coli, c’è una pressione selettiva per mantenere di simmetria (cioè, due braccia di lunghezza quasi uguale replica) del cromosoma19. I dati, DARS1e DARS2 regioni hanno la stessa distanza relativa di oriC in tutti gli e. coli ceppi sequenziati18, malgrado le grandi variazioni nella dimensione del cromosoma.
Qui, usiamo la regione DARS2 di e. coli come esempio per identificare le posizioni cromosomiche ottimale per la sua funzione. DARS2 è stato inserito il trasposone NKBOR e il risultante NKBOR::DARS2 trasposone successivamente inserito in modo casuale nel genoma di MG1655 ΔDARS2. Abbiamo così generato un insieme di celle, ogni possesso DARS2 collocato in una posizione diversa sul cromosoma. In vitro concorrenza esperimento, dove tutte le celle nell’insieme sono state riunite ed ha Gareggiate contro l’altro durante la crescita continua in LB per un stimato 700 generazioni, è stato effettuato. Il risultato dell’esperimento concorrenza è stato monitorato/determinato tramite Southern blot, gene facile camminare e sequenziamento intero genoma (WGS; Figura 1). Cloni di end-point risolti da gene facile a piedi sono stati caratterizzati mediante citometria a flusso per valutare i parametri del ciclo cellulare. In un’analisi cytometric di flusso, dimensioni della cella, il contenuto di DNA e sincronia di iniziazione può essere misurati per un gran numero di cellule. Durante il flusso cytometry, un flusso di singole cellule passa un fascio di luce della lunghezza d’onda appropriata per eccitare il DNA macchiato, che quindi è contemporaneamente registrato dai fotomoltiplicatori che raccolgono la fluorescenza emessa, una misura del contenuto di DNA, purché il le cellule sono macchiate per il DNA. La luce diffusa diretta è una misura della massa cellulare20.
L’esperimento in vitro concorrenza che vi presentiamo qui è utilizzato per affrontare questioni relative all’importanza della posizione cromosomica e contesto genomico dell’elemento genetico. Il metodo è imparziale e facile da usare.
La metodologia utilizzata qui si avvale di tecniche di state-of-the-art di rispondere a una domanda difficile per quanto riguarda la posizione ottimale di genomica di un elemento genetico. L’inserimento casuale dell’elemento genetico (mediata dal trasposone) consente la facile e veloce raccolta di migliaia di cloni, che poi possono essere fatto per competere contro l’altro per selezionare per la posizione ottima dell’elemento genetico studiato (cioè il clone più allenato).
Qui, …
The authors have nothing to disclose.
Gli autori sono stati finanziati mediante sovvenzioni della Fondazione di Novo Nordisk, la Fondazione di Lundbeck e il Danish National Research Foundation (DNRF120) attraverso il centro per batterica risposta allo Stress e persistenza (BASP).
Autoclaved Mili-Q water | None | ||
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
Chloroform | Merck | 2445 | |
Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
Apogee A10 instrument | Apogee |