Summary

Determinazione dei percorsi cromosomici ottimali per un elemento di DNA in Escherichia coli usando un approccio novello Transposon-mediata

Published: September 11, 2017
doi:

Summary

Qui, il potere di un’inserzione casuale transposon-mediata di un elemento di DNA non codificante è stato usato per risolvere la sua ottimale posizione cromosomica.

Abstract

Le posizioni cromosomiche ottimale di un dato elemento di DNA è stato/sono state determinate mediante inserimento casuale transposon-mediata seguita dalla selezione di fitness. Nei batteri, l’impatto del contesto genetico sulla funzione di un elemento genetico può essere difficile da valutare. Parecchi meccanismi, compreso gli effetti topologici, interferenza trascrizionale da geni vicini, e/o dosaggio genico replica-collegato, possono influenzare la funzione di un dato elemento genetico. Qui, descriviamo un metodo che consente l’integrazione casuale di un elemento di DNA nel cromosoma di Escherichia coli e selezionare le posizioni più favorevoli utilizzando una concorrenza crescita semplice esperimento. Il metodo si avvale di un sistema basato su trasposone ben descritto di inserimento casuale, accompagnato da una selezione del clone(s) più adatto nel vantaggio di crescita, una procedura che è facilmente regolabile per esigenze sperimentali. La natura del clone(s) più adatto può essere determinata mediante sequenziamento intero genoma su una popolazione multi-clonale complesso o dal gene facile a piedi per la rapida identificazione di cloni selezionati. Qui, la regione di DNA non codificante DARS2, che controlla l’avvio della replica del cromosoma in e. coli, è stata usata come esempio. La funzione di DARS2 è noti per essere interessati da dosaggio genico replica-collegato; il più vicino DARS2 Ottiene l’origine di replicazione del DNA, diventa più attivo. DARS2 casualmente è stato inserito nel cromosoma di un DARS2-eliminato il ceppo. I cloni risultanti contenente singoli inserimenti sono stati riuniti ed ha gareggiati uno contro l’altro per centinaia di generazioni. Infine, i cloni più adatti sono stati caratterizzati e trovati per contenere DARS2 inserita nella prossimità vicina alla posizione originale di DARS2 .

Introduction

La funzione di qualsiasi elemento genetico può essere influenzata dalla sua posizione nel genoma. Nei batteri, questo dipende principalmente da interferenze dalla trascrizione di geni vicini, topologia del DNA locale e/o dosaggio genico replica-collegata. In particolare, i processi di replicazione del DNA e di segregazione sono controllati, almeno in parte, di regioni cromosomiche non codificanti1e la funzione di queste regioni dipende dalla posizione/contesto genomico. In e. coli, gli esempi sono il sito di dif , necessario per la sorella del cromosoma risoluzione2; Sequenze KOPS, richiesti per di segregazione del cromosoma3; dati, DARS1e regioni DARS2 , necessarie per il controllo della corretta replica cromosomica (sotto; 4). vi presentiamo un metodo che consente il trasferimento casuale, selezione e determinazione del contesto genetico ottimo di ogni singolo elemento genetico, esemplificato qui dallo studio della regione non codificante DARS2 .

In e. coli, DnaA è la proteina di iniziatore responsabile filo del DNA di apertura presso la replica singola origineoriCe per l’assunzione di elicasi DnaB5,6,7. DnaA appartiene alla AAA+ (cioè, ATPasi associata con attività diverse) proteine e può legare ATP e ADP con simile ad alta affinità5. Il livello di DnaAATP picchi a iniziazione8, dove DnaAATP forma un multimer su oriC che innesca il DNA duplex apertura9. Dopo l’inizio, oriC fatta temporaneamente non disponibile per riattivazione a causa del sequestro di un meccanismo che coinvolge l’associazione della proteina SeqA per hemimethylated oriC10,11. Durante il sequestro, il livello di DnaAATP è ridotto di almeno due meccanismi: l’inattivazione normativo di DnaA (RIDA)12,13 e dati-dipendente DnaAATP idrolisi (DDAH)14 ,15. RIDA sia DDAH promuovere la conversione di DnaAATP a DnaAADP. Prima di un nuovo ciclo di iniziazione, DnaAADP è riattivato per DnaAATP alle sequenze specifiche di riattivazione di DnaA (DARS): DARS1 e DARS216,17. Cromosomiche dati, DARS1, regionie DARS2 sono non-codificazione e agire in un modo tipo di chaperon per modulare DnaAATPl’interconversione diADP di /DnaA. Queste regioni, che si trova di fuori l’origine di replicazione, consentono il montaggio di un complesso di DnaA per entrambi l’inattivazione (dati; 14) o l’attivazione (DARS1 e DARS2; 17) di DnaA. L’eliminazione di DARS2 in una cella non altera massa raddoppio tempo ma risultati in replica asincrona iniziazione15,16,18. Tuttavia, DARS2-cellule carenti hanno una palestra costo rispetto ad un altrimenti isogeniche wildtype durante sia concorso di continua crescita in mezzo ricco o durante l’istituzione della colonizzazione dell’intestino del mouse18. Ciò indica che anche i più piccoli cambiamenti nella concentrazione di asincronia/origine hanno un effetto negativo sul fitness batterica. In e. coli, c’è una pressione selettiva per mantenere di simmetria (cioè, due braccia di lunghezza quasi uguale replica) del cromosoma19. I dati, DARS1e DARS2 regioni hanno la stessa distanza relativa di oriC in tutti gli e. coli ceppi sequenziati18, malgrado le grandi variazioni nella dimensione del cromosoma.

Qui, usiamo la regione DARS2 di e. coli come esempio per identificare le posizioni cromosomiche ottimale per la sua funzione. DARS2 è stato inserito il trasposone NKBOR e il risultante NKBOR::DARS2 trasposone successivamente inserito in modo casuale nel genoma di MG1655 ΔDARS2. Abbiamo così generato un insieme di celle, ogni possesso DARS2 collocato in una posizione diversa sul cromosoma. In vitro concorrenza esperimento, dove tutte le celle nell’insieme sono state riunite ed ha Gareggiate contro l’altro durante la crescita continua in LB per un stimato 700 generazioni, è stato effettuato. Il risultato dell’esperimento concorrenza è stato monitorato/determinato tramite Southern blot, gene facile camminare e sequenziamento intero genoma (WGS; Figura 1). Cloni di end-point risolti da gene facile a piedi sono stati caratterizzati mediante citometria a flusso per valutare i parametri del ciclo cellulare. In un’analisi cytometric di flusso, dimensioni della cella, il contenuto di DNA e sincronia di iniziazione può essere misurati per un gran numero di cellule. Durante il flusso cytometry, un flusso di singole cellule passa un fascio di luce della lunghezza d’onda appropriata per eccitare il DNA macchiato, che quindi è contemporaneamente registrato dai fotomoltiplicatori che raccolgono la fluorescenza emessa, una misura del contenuto di DNA, purché il le cellule sono macchiate per il DNA. La luce diffusa diretta è una misura della massa cellulare20.

L’esperimento in vitro concorrenza che vi presentiamo qui è utilizzato per affrontare questioni relative all’importanza della posizione cromosomica e contesto genomico dell’elemento genetico. Il metodo è imparziale e facile da usare.

Protocol

1. collezione della biblioteca Transposon Nota: il locus DARS2 cromosomico è stato clonato nel mini Tn 10-base di trasposoni, NKBOR (il pNKBOR) 21, conseguente NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR può essere ottenuta online 22. pNKBOR è un vettore basato su R6K suicidio che richiede l’iniziatore della proteina π per replica 23. Plasmide pJFM1 è quindi in grado di replicare in un ceppo di e. …

Representative Results

Una macchia del sud è stato fatto per verificare che DARS2 era distribuito in modo casuale in tutto il cromosoma nella libreria trasposone (t = 0) e che i cloni più adatti sarebbero permangono nel tempo. Il Southern blot è stato effettuato su DNA estratto dal pool del trasposone iniziale (t = 0) e ogni 100 stimato fuori 700 generazioni della concorrenza (Figura 3). Qui, il DNA cellulare totale da ogni punto di tempo è stato digerito con Pvu</…

Discussion

La metodologia utilizzata qui si avvale di tecniche di state-of-the-art di rispondere a una domanda difficile per quanto riguarda la posizione ottimale di genomica di un elemento genetico. L’inserimento casuale dell’elemento genetico (mediata dal trasposone) consente la facile e veloce raccolta di migliaia di cloni, che poi possono essere fatto per competere contro l’altro per selezionare per la posizione ottima dell’elemento genetico studiato (cioè il clone più allenato).

Qui,

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori sono stati finanziati mediante sovvenzioni della Fondazione di Novo Nordisk, la Fondazione di Lundbeck e il Danish National Research Foundation (DNRF120) attraverso il centro per batterica risposta allo Stress e persistenza (BASP).

Materials

Autoclaved Mili-Q water None
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm Thermo Fisher Scientific P41050
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System Bio-Rad 165-2100
LB Broth Thermo Fisher Scientific 12780029 
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific 22700025
Glycerol Thermo Fisher Scientific 17904
Fisherbrand Plastic Petri Dishes Fisher Scientific S33580A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A
Nunc CryoTubes Sigma-Aldrich V7634 
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Fisher Scientific F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi PerkinElmer BLU012H250UC
DECAprime II DNA Labeling Kit Thermo Fisher Scientific AM1455
Spectrophotometer  SF/MBV/03.32 Pharmacia
Hermle Centrifuge    SF/MBV/03.46 Hermle
Ole Dich Centrifuge  SF/MBV/03.29 Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL Sigma-Aldrich T9661
Eppendorftubes 2.0 mL Sigma-Aldrich T2795
Sodium Chloride Merck 6404
96% Ethanol Sigma-Aldrich 16368
Trizma HCl Sigma-Aldrich T-3253
Phenol Ultra Pure BRL 5509UA
Chloroform Merck 2445
Ribonuclease A type II A Sigma-Aldrich R5000
Sodiumdodecylsulphate (SDS) Merck 13760
Lysozyme Sigma-Aldrich L 6876
Isopropanol Sigma-Aldrich 405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0 BRL 5575 UA
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 10106801001
PvuI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0621
UltraPure Agarose Thermo Fisher Scientific 16500500
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T4415
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 433160
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 71687
Whatman 3MM papers Sigma-Aldrich WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639
Amersham Hybond-N+ GE Healthcare RPN119B
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F8016
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40
Bovine Serum Albumin – Fraction V Sigma-Aldrich 85040C
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma-Aldrich D1626
Carestream Kodak  BioMax  light film Sigma-Aldrich Z373494
GenElute  Gel Extraction Kit Sigma-Aldrich NA1111 
GenElute  PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich NA1020
T100  Thermal Cycler Bio-Rad
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad
Rifampicin Serva 34514.01
Cephalexin Sigma-Aldrich C4895
Mithramycin Serva 29803.02
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Apogee A10 instrument Apogee

References

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Frimodt-Møller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Løbner-Olesen, A. Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach. J. Vis. Exp. (127), e55946, doi:10.3791/55946 (2017).

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