Enteroendokrin Hücre Gut Hormon salgısını Çalışması ve Canlı Hücre Görüntüleme için Amaçlanan Kemirgen Küçük Bağırsak Karışık İlköğretim Kültürler
Summary
Bu protokol karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü anlatılmaktadır. Bu primer bağırsak kültürler bir takım teknikler kullanılarak bağırsak peptidi salgısının temel sinyal yollarının inceleme sağlar.
Abstract
bağırsak mide-bağırsak epiteli boyunca yer alan hormon salgılayan enteroendokrin hücreleri ile vücudun en büyük endokrin organdır. fizyolojik önemine rağmen, enteroendokrin hücreler epitel hücre popülasyonunun yalnızca küçük bir bölümünü temsil eden ve geçmişte, kendi karakterizasyon hücre hattı modellerinde bir güven sonuçlanan önemli bir meydan okuma sundu. Burada, karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu birincil kültürleri besin ve bir çok nöropeptid yanıt olarak farmakolojik ajanlar olarak uyarılması ve bağırsak peptidi salgısının engellenmesini temel sinyal yollarını tespit etmek için kullanılmıştır. Ayrıca transgenik flüoresan raportör farelerin kullanılması ile kombinasyon halinde, bu birincil kültürde en floresan etiketli enteroendokrin hücre elde edilmesi için güçlü bir araç haline olduğunu göstermiştiryama sıkıştırma ve tek hücre kalsiyum ve cAMP FRET görüntüleme gibi yöntemler kullanılarak ekstrasellüler seviyesi.
Introduction
Bu yöntemin genel hedefi bağırsak peptid salgısı ve enteroendokrin hücrelerinin canlı hücre görüntüleme çalışması sağlamak için izole etmek ve kültür karışık fare bağırsak hücreleri etmektir. Bu prosedürün erken bir versiyonu orijinal olarak Reimann ve arkadaşları tarafından 2008 yılında yayımlandı. 1 ve yana gruptan ilave 20 yayın temelini oluşturmuştur. Bu yazının için, onlar kolon kültürlere daha kurmak daha zor olduğu gibi küçük bağırsak kültürlerin odaklanmayı seçti.
Enteroendokrin hücreler, glukagon-benzeri peptid 1 (GLP-1), glukoza bağımlı (GIP) insülinotropik peptid, kolesistokinin (CCK) ve peptid YY (PYY) 2 dahil olmak üzere bağırsak peptidlerin bir dizi salgılar. Bu bağırsak peptidleri gibi bağırsak geçiş, glikoz ile uyarılan insülin salımı ve tokluğun potansiye yavaşlaması olarak tokluk tepkileri düzenlenmesinde önemli fizyolojik rolleri vardır. GLP-1 mimetikleri birND olarak bozulmasını engelleyen ilaçlar tip 2 diyabet tedavisi için lisanslıdır ve bu peptidin 3 endojen salgılanmasını uyarıcı tedavi edici potansiyelinin bir sürekli değerlendirme vardır. enteroendokrin fizyolojisinin daha iyi anlaşılması ve sekresyon stimüle ya da inhibe edilir, ya hangi mekanizma ile kritik bir öneme sahip, bu nedenle,.
Peptid salgısı, in vitro ve ex vivo deneysel model, avantajları ve dezavantajları olan, her bir çeşidi kullanılarak incelenebilir Gut (aynı zamanda in vivo modellerin kullanılmasını kapsayan geniş kapsamlı bir güncel bir değerlendirme için Svendsen et al. 4). Bu tür izole edilmiş perfüze bağırsak 5 ve Ussing odası 6 Ex vivo teknikleri halen çeşitli maddelere tepki olarak bağırsak peptidi salınımını keşfetmek için kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin başlıca avantajı olarakBirincil kültürler ile karşılaştırıldığında, enteroendokrin hücrelerinin anlık çevre büyük ölçüde sağlam kalır ve daha önemlisi, hücre polarite korunmuş olmasıdır. Nedenle, bir salgı 6 üzerine etki eden olan hücre yüzeyi ile ilgili bilgiyi elde etmek mümkündür. Bununla birlikte, bu, genellikle düşük verimli teknikleri ve bunlardan türetilen verilerin kalitesi kaçınılmaz zaman içinde azalma bağırsak dokularının bütünlüğünün ve canlılığı, dayanır.
Bağırsak organoids artık giderek enteroendokrin hücre fonksiyonu ve gelişimi 7 çalışma için in vitro model olarak kullanılmaktadır. Kemirgen ve insan dokusu hem de türetilebilir Organoids, kültür içinde hücre polarite muhafaza 3D 'kript benzeri yapıları oluşturan bir yararı vardır. Bununla birlikte, organoid türetilmiş enteroendokrin hücreleri henüz tam olarak karakterize edilmesi için olan ve doğal L cel kendi benzerlikls büyük ölçüde bilinmemektedir. enteroendokrin hücrelerinin üretimi muhafaza ve uzun zaman süreleri için yapay koşullar ayırt edilmez olarak birincil kültürleri, bir adım daha yakın fizyolojik ayarına olma avantajına sahiptir.
Bağırsak peptidi salgısının değerlendirilmesi için kullanılan edilmiş Alternatif bir birincil kültür metodu cenin sıçan barsak hücreleri (FRICS) 8 izolasyondur. Bununla birlikte, yetişkin bağırsak doku kültürü az bir başarı elde etmiştir ve bazı farklılıklar FRICS genel yetişkin fare bağırsak hücrelerinin (örneğin glikoz 8) yanıt verme gözlenmiştir.
Enteroendokrin-benzeri hücre hatları (örn GLUTag STC-1 ve NCI-H716), geleneksel olarak karşı doğrudan ayırmak için kullanılmıştır. dolaylı etkiler entero- hücrelerde ve salgılama için uyaran bağlanması altında yatan moleküler mekanizmaların tahlil edilmesi; bakınız Kuhre ve ark </em>. L 'hücre-benzeri' ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri yoluyla peptid üretimi ve salgılanması için 9. Bu gastrointestinal sistem boyunca dağınık enteroendokrin hücreler, gerekli olmuştur sadece bağırsak epitel hücreleri 10 ve sıralanmış hücrelerin% 1 altında, bizim elimizde, kültür 1'de hayatta yoktur oluşturmaktadır. Hücre hatları bunlar gen sessizleştirme olarak genetik manipülasyonlar için elverişli olan bir büyük ölçüde homojen bir hücre popülasyonu olmasından dolayı yararlı araçlar kalır. Sonuç olarak, transgenik fare, mevcut olmadığında, farmakolojik olarak hedeflenen edilemez proteinlerin rolünü araştırmak için kolaydır. Ancak, hücre hatları her zaman birincil hücrelerin geçerli modeller değildir. Birçok benzerlikler vesileyle GLUTag hücrelere kıyasla birincil L hücrelerinde belirli besinlerin aktive sinyal yollarının farklılıkları sermiştir birincil kültürlerden bulgular varken, örneğin (örn. Peptonlar <sup class = "xref"> 11). En önemlisi, transgenik flüoresan raportör fareler ile kombinasyon halinde, primer kültürü modeli, hücre içi düzeyde bireysel birincil enteroendokrin hücrelerinin detaylı inceleme sağlar. Birincil kültürler içinde floresan-etiketli L hücreleri yama kalsiyum 11, 13 ve siklik adenosin monofosfat-FRET görüntüleme enteroendokrin alanında önemli gelişmeler vermiştir 14 çalışmalar, 1, 12 çalışmalar ve tek hücreli sıkma için bir grup tarafından kullanılmaktadır fizyoloji.
Aşağıdaki protokol, tek bir yetişkin fare ince bağırsağın, 10 cm bölümünden, salgılama deneyler bir 24-çukurlu plaka kullanılarak ya da 16 adete kadar görüntüleme yemeklerin hazırlanması için optimize edilmiştir. protokol kolayca sindirim süreleri ve işbirliği artırarak kolon hücrelerinin çalışma için değiştirilebilirllagenase konsantrasyonu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol bağırsak peptid salgısı ve etiketli enteroendokrin hücrelerinin tek bir hücre görüntüleme çalışması sağlamak için karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü anlatılmaktadır.
ince bağırsak kültürler başarılı olma olasılığını artırmak amacıyla, protokolü (doku hasat 3 saat içinde, ideal olarak) mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilir bu ve doku buz soğukluğunda bir ortamda tutulur ya da önceki tampon önemlidir sindirim işlemine hücre ölümlerini sınırlayabilir. özellikle kolon kültürlerin değil, şart iken, ince bağırsak kas tabakasının uzaklaştırılması kuvvetle teşvik edilir. ince bağırsak kültür protokolü mümkün olduğunca standardize edilmiştir. Ancak, hiçbir sindirim süreci özdeş olduğuna dikkat etmek önemlidir. Değişkenlik kas atılma derecesiyle mesela bir gün-gün bazında sokulabilir Bu protokol sırasında birçok adımlar, t boyutu vardırO, çalkalama gücünü, kolajenaz vb belirli bir yığınının gücünü doku parçaları 'kıyılmış'. Sindirim işlemi ve isteğe uydurmak için çalkalanarak ilerlemesini ve "dijest buna göre sayısını belirlemek için mikroskop altında 'dijest farklı her bir hacimde incelemek için büyük önem taşımaktadır, bu nedenle. kript fragmanları gelen belirgin değildir eğer, başlamak için daha nazikçe sallamak için tavsiye edilir ve daha kuvvetli sallayarak başlatmak için, itibaren 3 'sindirmek'.
Bizim deneyim, enteroendokrin hücreler kültürde çoğalmadığı ve genellikle 4 gün içinde ince bağırsak kültürlerden kaybolur. Bununla birlikte, bu bağırsak peptidi salgılama deneyleri için yeterli zaman fizyolojik uyaranlara ve / veya farmakolojik maddelerin test edilmesi için (tipik olarak 2 saat, 18-24 saat sonra kaplama üzerinde gerçekleştirilen) sağlar. Salgılama deneyden önce bir gece boyunca inkübasyon gerektiren deneyler de yapılabilir, örneğin vardırboğmaca toksini 15 ile ön muamele durumunda.
Yıllar boyunca üretti araştırma üretim hacminde ile kanıtlandığı gibi burada sunulan primer kültürü tekniği, iyi kurulmuş bir yöntemdir. Birincil kültürü modeli, çeşitli besin ve besin olmayan 14, 20, uyaranlara ve inhibitörlerine tepki olarak, GLP-1 1, GIP 18 ve PYY 19 de dahil olmak üzere bağırsak peptidleri, çeşitli salgılanmasını incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, aynı teknik başarılı bir insan bağırsak hücrelerine 21 kültür uygulanmıştır. Çoğu zaman, ilave bir deneysel model, örneğin birlikte, birincil hücre kültür metodu bir kombinasyonu olabilir. ex vivo veya in vivo olarak en kavrayış 6 sağlayabilir. Özellikle ve diğer yöntemlerle tersine, bu teknik im varbağırsak peptid salınımı ölçümü ötesinde nem li uygulamalar. Biz, sırasıyla örneğin kullanılarak Ca2 + ve cAMP sensörleri, GCaMP3 11, 13 ve Epac2camps 14 transgenik raportör farelerden türetilen primer küçük bağırsak kültürleri peptit salınımını gut bağlanmış hücre içi sinyal yollarının sorgulama için güçlü araçlardır olduğunu göstermiştir hem elektrofizyolojik teknikler 12 olarak gösterilmektedir.
Genel olarak in vitro modellerde olduğu gibi, primer intestinal kültürleri kültür epitel hücreler polarite kaybı, hem de kan akımı ve innervasyon kaybı da dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Enteroendokrin hücre fonksiyonu üzerine bu yapay koşulların olası etkilerini tahmin etmek zordur. Bununla birlikte, primer kültürlerden elde edilen veriler, genellikle in-vivo setti, dönüştürülebilir olmuşturng (GLP-1 sekresyonu 15 kısa zincirli yağlı asitlerin, örneğin etkisi).
Birincil bağırsak kültürleri birçok potansiyel uygulamalar ile çok yönlü bir tekniktir. Zaten bağırsak peptid sekresyonunun düzenlenmesi hakkında önemli mekanik önem kazanmasını sağlamıştır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
GLP-1 immuno-deneyler Addenbrooke Hastanesi Çekirdek Biyokimyasal Deneyi Laboratory tarafından gerçekleştirildi.
Bu çalışma, yıllar içinde, Wellcome Trust tarafından desteklenmiştir (şu anda aktif hibe 106.262 / Z / 14 / Z ve 106.263 / Z / 14 / Z) ve Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) (hibe MRC_MC_UU_12012 / 3 ve MRC_MC_UU_12012 / 5).
Materials
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 ml, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/ digestion |
| Centrifuge tubes, 50 ml, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | – | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | – | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium) |
References
- Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. Glucose sensing in L cells: A primary cell study. Cell Metab. 8, 532-539 (2008).
- Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. Gut chemosensing mechanisms. J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).
- Lovshin, J. A., Drucker, D. J. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).
- Brighton, C. A., et al. Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors. Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).
- Brubaker, P. L., Vranic, M. Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides. Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).
- Gerbe, F., et al. Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium. J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).
- Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells. Peptides. 77, 9-15 (2016).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).
- Emery, E. C., et al. Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1. Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).
- Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells. Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).
- Tolhurst, G., et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).
- Richards, P., et al. High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells. Peptides. 77, 21-27 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells. Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).
- Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans. Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).
- Moss, C. E., et al. Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents. Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).
- Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells. Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).
