Gemengde Primaire culturen van Muizen dunne darm Bestemd voor de Studie van Gut hormoon en live cell imaging van entero-Cells
Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie en kweek van gemengde muis kleine darmcellen. Deze primaire kweken intestinale maken het onderzoek signaalroutes onderliggende darm peptidesecretie behulp van een aantal technieken.
Abstract
De darm is de grootste endocrien orgaan van het lichaam, met afscheidende entero-endocriene cellen die zich langs de lengte van het maag-epitheel. Ondanks hun fysiologisch belang, entero-endocriene cellen slechts een kleine fractie van de epitheliale celpopulatie en in het verleden hun karakterisatie aanzienlijke uitdaging resulteert in een afhankelijkheid cellijn modellen gepresenteerd. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en de cultuur van gemengde muizen kleine darmcellen. Deze primaire kweken werden gebruikt om de signaalwegen onderliggende stimulatie en remming van darm peptidesecretie identificeren in responsie op een aantal voedingsstoffen en neuropeptiden als farmacologische middelen. Verder wordt in combinatie met het gebruik van transgene fluorescente reporter muizen, hebben we aangetoond dat deze primaire kweken een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van fluorescent-gemerkte entero-endocriene cellen bij het intracellular niveau, onder toepassing van werkwijzen zoals patchklemmen en eencellige calcium en cAMP-FRET beeldvorming.
Introduction
De algemene doelstelling van deze methode is om te isoleren en cultuur gemengde muizen darmcellen aan de studie van darm peptide secretie en live cell imaging van entero-endocriene cellen mogelijk te maken. Een vroege versie van deze procedure werd oorspronkelijk gepubliceerd in 2008 door Reimann et al. 1 en is sindsdien vormde de basis van een verdere 20 publicaties van onze groep. Voor dit manuscript, hebben we gekozen om zich te concentreren op de dunne darm culturen zoals ze zijn moeilijker vast te stellen dan colon culturen.
Entero-endocriene cellen scheiden een reeks darmpeptiden waaronder glucagon-achtig peptide 1 (GLP-1), glucose-afhankelijke insulinotrope peptide (GIP), cholecystokinine (CCK) en peptide YY (PYY) 2. Deze darmpeptiden hebben belangrijke fysiologische rol bij het orkestreren van de postprandiale respons zoals het vertragen van de darm doorvoer, versterking van glucose gestimuleerde insulineafgifte en inductie van verzadiging. GLP-1 mimetica and geneesmiddelen die de afbraak remmen momenteel goedgekeurd voor de behandeling van type 2 diabetes en er continue evaluatie van het therapeutisch potentieel van het stimuleren van de endogene secretie van dit peptide 3. Een beter begrip van entero-endocriene fysiologie en de mechanismen waarvan secretie ofwel gestimuleerd of geremd is dus van cruciaal belang.
Gut peptidesecretie kan worden onderzocht met verschillende in vitro en ex vivo experimentele modellen, elk met voor- en nadelen (voor een uitgebreide recente herziening ook betrekking tot het gebruik van in vivo modellen wordt Svendsen et al. 4). Ex vivo technieken zoals de geïsoleerde geperfuseerde darm 5 en 6 Ussingkamers worden momenteel gebruikt om gut peptidesecretie verkennen in reactie op verschillende stoffen. Het belangrijkste voordeel van deze methoden,vergeleken met primaire kweken, dat de directe omgeving van de entero-endocriene cellen blijft grotendeels intact en belangrijker, wordt de polariteit van de cellen behouden. Daarom is het mogelijk om informatie over welke celoppervlak een secretagogum handelt 6 wekken. Echter, deze zijn meestal low-throughput technieken en de kwaliteit van de gegevens die zijn afgeleid van hen is sterk afhankelijk van de integriteit en de levensvatbaarheid van het darmweefsel, wat onvermijdelijk verloop van tijd afnemen.
Intestinale organoids worden steeds meer gebruikt als in vitro modellen voor de studie van de entero- endocriene cel functie en ontwikkeling 7. Organoids, die kan worden afgeleid uit zowel muizen- als menselijke weefsels, hebben het voordeel van het vormen van 3D 'crypt-achtige' structuren die cel polariteit in kweek te handhaven. Echter, organoïde afgeleide entero-endocriene cellen nog niet volledig gekarakteriseerd en hun gelijkenis met natuurlijk L CELls blijft grotendeels onbekend. Primaire culturen hebben het voordeel dat dichterbij de fysiologische instelling waarbij entero-endocriene cellen niet worden onderhouden en gedifferentieerd kunstmatige omstandigheden gedurende lange tijdsperioden.
Een alternatieve primaire kweek methode die toegepast is voor de beoordeling van de darm peptidesecretie is de isolatie van foetale ratten darmcellen (FRICS) 8. Echter, de cultuur van volwassen darmweefsel heeft een ontmoeting gehad met minder succes en een aantal verschillen zijn waargenomen in het reactievermogen van FRICS vs. volwassen muizen darmcellen (bijvoorbeeld glucose 8).
Entero-achtige cellijnen (bijv GLUTag, STC-1 en NCI-H716) werden traditioneel gebruikt om onderscheid te maken tussen vs. indirecte effecten op entero-endocriene cellen en onderliggende moleculaire mechanismen koppelen stimulans secretie ontleden; Zie Kuhre et al </em>. 9 voor peptide productie en secretie van 'L celachtige' geïmmortaliseerde cellijnen. Dit is nodig omdat entero-endocriene cellen, verspreid langs het maagdarmkanaal geweest, vormen iets minder dan 1% van darmepitheelcellen 10 en gesorteerde cellen, in onze handen, niet overleven in cultuur 1. Cellijnen blijft nuttige instrumenten vanwege het feit dat ze een grotendeels homogene celpopulatie die bevorderlijk is voor genetische manipulaties zoals gen-silencing. Derhalve is het gemakkelijk om de rol van eiwitten die niet farmaceutisch kunnen worden gericht, terwijl transgene muizen zijn niet beschikbaar onderzoeken. Echter, cellijnen zijn niet altijd geldig modellen van primaire cellen. Hoewel er veel overeenkomsten, bevindingen uit primaire culturen soms verschillen aangetoond tussen de signaleringsroutes geactiveerd door bepaalde voedingsstoffen in primaire L-cellen ten opzichte van GLUTag cellen, bijvoorbeeld (bijv. Peptonen <sup class = "xref"> 11). Cruciaal in combinatie met fluorescerende reporter transgene muizen, de primaire kweek model kunnen uitvoeriger behandeling van afzonderlijke primaire entero- endocriene cellen in het intracellulaire niveau. Fluorescent gemerkte L-cellen in primaire kweken zijn gebruikt door onze groep patch klemmen 1, 12 studies en eencellige calcium 11, 13 en cyclisch adenosine monofosfaat-FRET beeldvorming 14 studies die aanzienlijke vooruitgang opgeleverd op het gebied van entero fysiologie.
Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor het uitvoeren secretie experimenten onder toepassing van een 24-wells plaat of voor de bereiding van maximaal 16 beeldvorming gerechten, van een 10 cm deel van de dunne darm van een volwassen muis. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast voor de studie van colon cellen door het verhogen digestietijden en collagenase concentratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de isolatie en kweek van gemengde muis kleine darmcellen de studie van darm peptidesecretie en single cell imaging gemerkte entero-endocriene cellen mogelijk.
Om de waarschijnlijkheid van de dunne darm kweken slagen vergroten, is het belangrijk dat het protocol zo snel mogelijk (bij voorkeur binnen 3 uur van het oogsten van het weefsel) wordt uitgevoerd en dat het weefsel in ijskoud medium gehouden of buffer voorafgaand aan het verteringsproces, om celdood te beperken. Hoewel het niet essentieel is, vooral voor colon culturen, is het verwijderen van de spierlaag van de dunne darm sterk aangemoedigd. De dunne darm cultuurprotocol gestandaardiseerd zoveel mogelijk. Het is echter belangrijk op te merken dat er geen verteringsproces is identiek. Er zijn veel stappen in dit protocol, waar variabiliteit op een dag-tot-dag basis kan worden ingevoerd bijvoorbeeld de mate van de spier te verwijderen, de grootte van thij gehakt 'weefselstukjes de sterkte schudden, de potentie van een bepaalde partij collagenase enz. Het is daarom van het grootste belang hoeveelheden van elk van de verschillende "digesten inspecteren onder de microscoop om de voortgang van het verteringsproces maat en de ratel en het aantal 'digest' dienovereenkomstig beoordelen. Het wordt aanbevolen om meer schud om te beginnen en zo de crypte fragmenten niet duidelijk uit 'digest' 3 verder te gaan trillen krachtiger.
Vanuit onze ervaring, entero-endocriene cellen niet vermenigvuldigen in cultuur en zijn meestal verloren van de dunne darm culturen binnen 4 dagen. Toch is dit laat voldoende tijd om gut peptidesecretie experimenten fysiologische prikkels en / of farmacologische middelen te testen (gewoonlijk over 2 uur, 18-24 uur na plateren uitgevoerd). Experimenten die een incubatie overnacht vóór de afscheiding experiment zijn ook mogelijk bvbij voorbehandeling met pertussis toxine 15.
De primaire kweek techniek hier wordt gepresenteerd is een bekende methode, zoals blijkt uit de omvang van de onderzoeksoutput het heeft door de jaren heen geproduceerd. De primaire kweek model werd gebruikt om de uitscheiding van een verscheidenheid aan darmpeptiden, waaronder GLP-1 1, GIP 18 en 19 PYY bestuderen in reactie op diverse nutriënten en non-nutriënten 14, 20 prikkels en remmers. Verder dezelfde techniek is met succes toegepast voor de kweek van humane darmcellen 21. Vaak is een combinatie van de primaire celkweek werkwijze tezamen met een aanvullend experimenteel model bv. ex vivo of in vivo kan de meest inzicht 6 te bieden. Met name en in tegenstelling tot andere methoden, deze techniek heeft important toepassingen buiten het meten van darm neuropeptidevrijgave. We hebben aangetoond dat primaire dunne darm kweken afgeleid van transgene reportermuizen krachtige instrumenten voor het ondervragen van intracellulaire signaleringsroutes gekoppeld met peptidesecretie gut, waarbij bijvoorbeeld Ca2 + en cAMP sensors, GCaMP3 11, 13 en Epac2camps 14 respectievelijk en elektrofysiologische technieken 12.
Zoals bij alle in vitro modellen, de primaire kweken intestinale hebben bepaalde inherente beperkingen waaronder het verlies van polariteit van de epitheliale cellen in kweek, en het verlies van toevoer en innervatie bloed. Het is moeilijk om de mogelijke gevolgen van deze kunstmatige omstandigheden te schatten op enteroendocrine celfunctie. Echter, gegevens verkregen uit primaire culturen vaak transleerbaar in de in vivo setti geweestng (zoals de invloed van korte-keten vetzuren op GLP-1 uitscheiding 15).
De primaire intestinale culturen zijn een veelzijdige techniek met vele mogelijke toepassingen. Zij hebben reeds belangrijk mechanistisch inzicht in de regulering van de darm peptide secretie.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
GLP-1 immuno-assays werden uitgevoerd door de Core Biochemical Assay Laboratory in Addenbrooke's Hospital.
Dit werk heeft in de loop der jaren, ondersteund door de Wellcome Trust (momenteel actief subsidies 106262 / Z / 14 / Z en 106263 / Z / 14 / Z) en de Medical Research Council (MRC) (subsidies MRC_MC_UU_12012 / 3 en MRC_MC_UU_12012 / 5).
Materials
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 ml, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/ digestion |
| Centrifuge tubes, 50 ml, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | – | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | – | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium) |
References
- Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. Glucose sensing in L cells: A primary cell study. Cell Metab. 8, 532-539 (2008).
- Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. Gut chemosensing mechanisms. J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).
- Lovshin, J. A., Drucker, D. J. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).
- Brighton, C. A., et al. Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors. Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).
- Brubaker, P. L., Vranic, M. Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides. Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).
- Gerbe, F., et al. Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium. J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).
- Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells. Peptides. 77, 9-15 (2016).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).
- Emery, E. C., et al. Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1. Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).
- Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells. Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).
- Tolhurst, G., et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).
- Richards, P., et al. High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells. Peptides. 77, 21-27 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells. Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).
- Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans. Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).
- Moss, C. E., et al. Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents. Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).
- Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells. Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).
