Смешанные первичные культуры мышиных тонкой кишки, предназначенные для изучения Gut Гормон Секреции и живых изображений клеток из клеток энтероэндокринных
Summary
Этот протокол описывает выделение и культуру смешанных мышиных клеток тонкого кишечника. Эти первичные культуры кишечника позволяют исследование сигнальных путей, лежащих в основе секреции пептида кишечника с использованием ряда методов.
Abstract
Кишка является самым большим эндокринным органом тела, с энтероэндокринные клеток, секретирующих гормон-расположенных вдоль длины желудочно-кишечного эпителия. Несмотря на их физиологическое значение, энтероэндокринные клетки представляют собой лишь небольшую часть населения эпителиальных клеток и в прошлом, их характеристика представила значительные трудности в результате в зависимости от модели клеточных линий. Здесь мы приводим подробный протокол для выделения и культуры смешанных мышиных клеток тонкого кишечника. Эти первичные культуры были использованы для идентификации сигнальных путей, лежащих в основе стимуляции и ингибирование секреции пептида кишечника в ответ на ряд питательных веществ и нейропептиды, а также в качестве фармакологических агентов. Кроме того, в сочетании с использованием трансгенных флуоресцентных мышей репортера, мы показали, что эти первичные культуры стали мощным инструментом для исследования флуоресцентно меченного энтероэндокринных клеток в инtracellular уровень, используя методы, такие как патч зажима и одноклеточного кальция и визуализации цАМФ-FRET.
Introduction
Общая цель этого метода заключается в изоляции и культуры смешанных мышиные клеток кишечника для того, чтобы исследования секреции кишечника пептидов и клеточной визуализации энтероэндокринных клеток живой. Ранняя версия этой процедуры была впервые опубликована в 2008 году Рейман и др. 1 и с тех пор легли в основу еще 20 публикаций из нашей группы. Для этой рукописи, мы решили сосредоточиться на небольших кишечных культурах, поскольку они являются более сложными, чтобы установить, чем ободочная культур.
Энтероэндокринные клетки секретируют множество кишечных пептидов , включая глюкагон-подобный пептид 1 (GLP-1), глюкозо-инсулинотропный пептид (GIP), холецистокинин (CCK) и пептида YY (PYY) 2. Эти кишечные пептиды играют важную физиологическую роль в организуя постпрандиальную реакцию, такие как замедление транзита кишечника, потенцирование глюкозо-стимулированной секреции инсулина и индукции сытости. GLP-1 миметики ай препараты , которые ингибируют его деградацию в настоящее время лицензированы для лечения сахарного диабета 2 -го типа и существует постоянная оценка терапевтического потенциала стимулировать секрецию эндогенной этого пептида 3. Лучшее понимание энтероэндокринных физиологий и механизмы, с помощью которых секреция либо стимулируется или подавляется, таким образом, решающее значение.
Gut секреции пептида может быть изучена с помощью различных в пробирке и бывших естественных экспериментальных моделей, каждая имеет свои преимущества и недостатки (для всестороннего недавнего обзора также охватывающее использование моделей в естественных условиях см Свендсен и др. 4). Ex естественных условий методы , такие как изолированная перфузия кишечника 5 и Ussing камеры 6 в настоящее время используется для изучения секреции пептида кишечника в ответ на различные вещества. Главное преимущество этих методов, так какпо сравнению с первичными культурами, является то, что непосредственное окружение из энтероэндокринных клеток остается в значительной степени нетронутого и, что важно, сохраняется полярность клеток. Таким образом, можно вызвать информацию о том, какие клетки поверхность а секрецию действует на 6. Однако, эти методы, как правило, низкой пропускной способности, а качество данных, полученных из них в значительной степени зависит от целостности и жизнеспособности ткани кишечника, что неизбежно снижаться с течением времени.
Кишечные органоиды теперь все чаще используются в качестве моделей в пробирке для исследования функции и развития 7 энтероэндокринных клеток. Органоиды, которые могут быть получены как из мышиных и человеческих тканей, имеют преимущество формирования 3D «крипт-подобный» структур, которые поддерживают полярность клеток в культуре. Тем не менее, органоидные полученные энтероэндокринные клетки до сих пор не полностью охарактеризованы, и их сходство с нативным L CELLs остается в значительной степени неизвестны. Первичные культуры имеют преимущество быть на шаг ближе к физиологическому установке, поскольку энтероэндокринные клетки не сохраняются и дифференцируются в искусственных условиях в течение длительных периодов времени.
Альтернативный метод первичной культуры , которая была использована для оценки секреции кишечника пептида является выделением кишечных клеток плода крысы (FRICS) 8. Однако культура кишечной ткани взрослого встретился с меньшим успехом , и некоторые различия наблюдались в отзывчивости FRICS против взрослых мышиных клеток кишечника (например , глюкозы 8).
Энтероэндокринные подобные клеточные линии (например , GLUTag, STC-1 и NCI-H716) традиционно используется , чтобы различать прямые против. косвенное воздействие на клетки и энтероэндокринных рассекать основные молекулярные механизмы сцепных стимул секрецию; см Kuhre др </em>. 9 для производства и пептида секреции «клеточноподобных L» иммортализованных клеточных линий. Это было необходимо , так как энтероэндокринные клетки, разбросанные вдоль желудочно – кишечного тракта, составляет чуть менее 1% эпителиальных клеток кишечника 10 и отсортированных клеток, в наших руках, не выживают в культуре 1. Клеточные линии остаются полезными инструментами в связи с тем, что они в значительной степени гомогенной клеточной популяции, которая способствует генетическим манипуляциям, таким как ген-глушители. Следовательно, легко исследовать роль белков, которые не могут быть целевыми фармакологический, когда трансгенные мыши не доступны. Однако, клеточные линии, не всегда действующие модели первичных клеток. В то время как есть много общих черт, выводы из первичных культур по поводу определения различий в сигнальных путях , активируемых определенных питательных веществ в первичных L клеток по сравнению с клетками GLUTag, например , (например, пептоны <вир класс = "внешние ссылки"> 11). Важно отметить, что в сочетании с трансгенными флуоресцентными мышами репортера, модель первичной культуры дает детальное изучение отдельных первичному энтероэндокринные клеток на внутриклеточном уровне. Флуоресцентно-меченый L клеток в первичных культурах, были использованы нашей группой для патч зажима 1, 12 исследований, а также для одной ячейки кальция 11, 13 и циклический аденозин монофосфат-FRET изображений 14 исследований, которые были достигнуты значительные успехи в области энтероэндокринные физиология.
Следующий протокол оптимизирован для выполнения экспериментов секреции, с использованием 24-луночного планшета с или для приготовления до 16 блюд изображений, из секции 10 см тонкой кишки от одной взрослой мыши. Протокол может быть легко модифицирован для изучения ободочных клеток путем увеличения времени пищеварения и сотрудничестваllagenase концентрация.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает выделение и культуру смешанных мышиных клеток тонкого кишечника, чтобы позволить исследование секреции кишечника пептида и одной клеточной визуализации меченых клеток энтероэндокринные.
Для того, чтобы увеличить вероятность тонкого кишечника культур быть успешным, важно, что протокол осуществляется так же быстро, как это возможно (в идеале, в течение 3 ч уборки ткани), и что ткань хранится в ледяной среде или буфера перед в процессе пищеварения, чтобы ограничить гибель клеток. Хотя это не является существенным, особенно для ободочных культур, удаление мышечного слоя из тонкого кишечника настоятельно рекомендуется. Небольшой протокол кишечной культуры был стандартизирован как можно больше. Тем не менее, важно отметить, что ни один процесс пищеварения не идентичен. Есть много шагов , в ходе этого протокола , где изменчивость может быть введена на основе изо дня в день , например , от степени удаления мышц, размер тон фарш "кусочки ткани, силу встряхивания, потенция конкретной партии коллагеназы и др. Следовательно, чрезвычайно важно, чтобы осмотреть аликвот каждого из различных «переваривает» под микроскопом, чтобы оценить ход процесса пищеварения и в соответствии с ними встряхивания и число «дайджесты» соответственно. Рекомендуется встряхнуть более осторожно, чтобы начать с, и если фрагменты крипт не очевидны из «переварить» 3 года, чтобы начать встряхивая более энергично.
Исходя из нашего опыта, энтероэндокринные клетки не размножаются в культуре и, как правило, теряется из тонкого кишечника культур в течение 4 дней. Тем не менее, это позволяет достаточно времени, чтобы выполнить эксперименты секреции кишечника пептид (обычно проводят в течение 2 ч, 18-24 ч после металлизации), чтобы проверить физиологические стимулы и / или фармакологических агентов. Эксперименты , требующие инкубации в течение ночи перед экспериментом секреции также возможно , например ,в случае предварительной обработки с коклюшного токсина 15.
Методика первичной культуры представлены здесь устоявшийся метод, о чем свидетельствует объем научной продукции она производится на протяжении многих лет. Модель первичной культуры была использована для изучения секреции различных кишечных пептидов, включая GLP-1 1, GIP 18 и PYY 19, в ответ на разнообразные питательные вещества и без питательных веществ 14, 20 стимулов и ингибиторов. Кроме того, тот же метод был успешно применен к культуре клеток кишечника человека 21. Часто, сочетание метода первичной клеточной культуры , наряду с дополнительной экспериментальной модели , например. ех естественных условиях или в естественных условиях может обеспечить наиболее понимание 6. Примечательно, и в отличие от других методов, этот метод имеет внутримышечноВАЖНЫ приложения за пределами измерения кишки пептидного высвобождения. Мы показали , что первичные культуры тонких кишечника , полученные из трансгенных мышей репортера являются мощными инструментами для допроса внутриклеточных сигнальных путей в сочетании кишки секреции пептида, используя, например , Са 2+ и датчики цАМФа, GCaMP3 11, 13 и 14 Epac2camps, соответственно, а также электрофизиологические методы 12.
Как и все модели в пробирке, первичные кишечные культуры имеют определенные ограничения , присущие включая потерю полярности эпителиальных клеток в культуре, а также к потере кровоснабжения и иннервации. Трудно оценить потенциальное влияние этих искусственных условий на функции энтероэндокринных клеток. Однако данные , полученные из первичных культур часто были переводимые в в естественных условиях Settiнг (например , эффекты короткоцепочечных жирных кислот на GLP-1 секреции 15).
Первичные культуры кишечника являются универсальным методом, с большим количеством потенциальных применений. Они уже обеспечили важное механистическое понимание регуляции секреции кишечника пептидов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
GLP-1, иммуно-анализы проводили с помощью анализа лаборатории биохимического Ядра в больнице Адденбрукса.
Эта работа, на протяжении многих лет, была поддержана Wellcome Trust (в настоящее время активные гранты 106262 / Z / 14 / Z и 106263 / Z / 14 / Z) и Совета по медицинским исследованиям (MRC) (гранты MRC_MC_UU_12012 / 3 и MRC_MC_UU_12012 / 5).
Materials
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 ml, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/ digestion |
| Centrifuge tubes, 50 ml, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | – | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | – | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium) |
References
- Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. Glucose sensing in L cells: A primary cell study. Cell Metab. 8, 532-539 (2008).
- Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. Gut chemosensing mechanisms. J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).
- Lovshin, J. A., Drucker, D. J. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).
- Brighton, C. A., et al. Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors. Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).
- Brubaker, P. L., Vranic, M. Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides. Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).
- Gerbe, F., et al. Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium. J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).
- Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells. Peptides. 77, 9-15 (2016).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).
- Emery, E. C., et al. Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1. Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).
- Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells. Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).
- Tolhurst, G., et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).
- Richards, P., et al. High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells. Peptides. 77, 21-27 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells. Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).
- Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans. Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).
- Moss, C. E., et al. Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents. Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).
- Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells. Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).
