الثقافات الابتدائية المختلطة الفئران الأمعاء الدقيقة المعدة للدراسة غوت هرمون إفراز ولايف التصوير خلية من خلايا Enteroendocrine
Summary
يصف هذا البروتوكول العزلة والثقافة من الخلايا المعوية صغيرة الفئران مختلطة. وتمكن هذه الثقافات المعوية الأولية التحقيق في مسارات الإشارات الكامنة الأمعاء الببتيد إفراز باستخدام عدد من التقنيات.
Abstract
القناة الهضمية هو أكبر جهاز الغدد الصماء في الجسم، مع خلايا enteroendocrine إفراز هرمون تقع على طول ظهارة المعدة والأمعاء. وعلى الرغم من أهميتها الفسيولوجية، وخلايا enteroendocrine لا تمثل سوى جزء صغير من السكان الخلايا الظهارية وفي الماضي، قدمت توصيف لها تحديا كبيرا مما أدى إلى الاعتماد على نماذج خط الخلية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة للعزلة وثقافة الخلايا المعوية صغيرة الفئران مختلطة. وقد استخدمت هذه الثقافات الأساسية لتحديد مسارات الإشارات الكامنة وراء تحفيز وتثبيط إفراز الأمعاء الببتيد في استجابة لعدد من المواد الغذائية ونيوروببتيد وكذلك وكلاء الدوائية. وعلاوة على ذلك، جنبا إلى جنب مع استخدام المعدلة وراثيا الفئران مراسل فلوري، لقد أثبتنا أن هذه الثقافات الأولية تصبح أداة قوية لفحص خلايا enteroendocrine fluorescently الموسومة في فيمستوى tracellular، وذلك باستخدام أساليب مثل لقط التصحيح والكالسيوم وحيدة الخلية والتصوير معسكر الحنق.
Introduction
ويتمثل الهدف العام من هذا الأسلوب هو عزل وثقافة مختلطة الخلايا المعوية الفئران لتمكين دراسة إفراز الأمعاء الببتيد والتصوير خلية حية من خلايا enteroendocrine. وقد نشرت نسخة مبكرة من هذا الإجراء أصلا في عام 2008 من قبل رايمان وآخرون. 1 وشكلت منذ أساس 20 المنشورات مزيد من مجموعتنا. لهذا المخطوط، اخترنا التركيز على الثقافات الأمعاء الصغيرة لأنها أكثر تحديا لإقامة من الثقافات القولون.
خلايا Enteroendocrine تفرز مجموعة من الببتيدات القناة الهضمية بما في ذلك تشبه الجلوكاجون الببتيد 1 (GLP-1)، insulinotropic الببتيد (GIP) التي تعتمد على الجلوكوز، كوليسيستوكينين (CCK) وYY الببتيد (PYY) 2. هذه الببتيدات الأمعاء لها أدوار الفسيولوجية الهامة في تنسيق الاستجابات بعد الأكل مثل تباطؤ عبور القناة الهضمية، التقوية لحفز إفراز الأنسولين الجلوكوز وتحريض الشبع. GLP-1 محاكيات لالثانية العقاقير التي تحول دون تدهورها مرخصة حاليا لعلاج مرض السكري من النوع 2، وهناك تقييم مستمر من الإمكانات العلاجية لتحفيز إفراز الذاتية من هذا الببتيد 3. فهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء enteroendocrine والآليات التي إفراز إما تحفيز أو تثبيط، لذلك، من الأهمية بمكان.
القناة الهضمية إفراز الببتيد يمكن دراستها باستخدام مجموعة متنوعة من في المختبر والمجراة سابقا نماذج تجريبية، ولكل منها مزايا وعيوب (لمراجعة شاملة مؤخرا أيضا تغطي استخدام في النماذج الحية نرى سفندسن وآخرون. 4). ويجري حاليا استخدام خارج الجسم الحي تقنيات مثل عزل الأمعاء 5 و غرفة أوسينج perfused ل6 لاستكشاف الأمعاء الببتيد إفراز ردا على المواد المختلفة. والميزة الرئيسية لهذه الأساليب، كمامقارنة الثقافات الأولية، هو أن البيئة المباشرة من الخلايا enteroendocrine لا يزال سليما إلى حد كبير، والأهم من ذلك، هو الحفاظ على الاستقطاب من الخلايا. لذلك، فمن الممكن الحصول على معلومات بشأن أي خلية سطح افراز يتصرف على 6. ومع ذلك، وهذه هي عادة تقنيات إنتاجية منخفضة وجودة البيانات المستمدة منها تعتمد اعتمادا كبيرا على سلامة وحيوية الأنسجة المعوية، التي تنخفض حتما مع مرور الوقت.
والآن يتزايد استخدام organoids الأمعاء كما هو الحال في المختبر نماذج لدراسة وظيفة الخلية enteroendocrine والتنمية 7. Organoids، والتي يمكن أن تستمد من كل من الفئران والأنسجة البشرية، لديها مصلحة تشكيل هياكل 3D "مثل سرداب" التي تحافظ على قطبية خلية في الثقافة. ومع ذلك، وخلايا enteroendocrine عضي المستمدة حتى الآن لم يتم تتميز بشكل كامل وتشابهها مع L سل الأصليليرة سورية لا تزال مجهولة إلى حد كبير. الثقافات الأولية لديها ميزة كونها خطوة أقرب إلى الإعداد الفسيولوجية، كما لا يتم الاحتفاظ خلايا enteroendocrine ومتباينة في ظروف اصطناعية لفترات طويلة من الزمن.
طريقة ثقافة الأساسي البديل الذي قد استخدمت لتقييم إفراز الأمعاء الببتيد هو عزل الخلايا المعوية الفئران الجنين (FRICs) 8. ومع ذلك، فقد التقى ثقافة الأنسجة المعوية الكبار مع أقل نجاحا، وقد لاحظ بعض الاختلافات في استجابة FRICs مقابل الكبار الخلايا المعوية الفئران (مثل الجلوكوز 8).
وقد جرت العادة على استخدام خطوط الخلايا مثل Enteroendocrine (على سبيل المثال GLUTag، STC-1 و NCI-H716) لتمييز مباشر مباراة. الآثار غير المباشرة على خلايا enteroendocrine ولتشريح الآليات الجزيئية الكامنة وراء اقتران حافزا لإفراز. رؤية Kuhre وآخرون </em>. 9 لإنتاج الببتيد وإفراز من خطوط الخلايا خلد "تشبه الخلايا L '. لقد كان هذا ضروريا خلايا enteroendocrine، المنتشرة على طول القناة الهضمية، تشكل أقل من 1٪ من الخلايا الظهارية في الأمعاء 10 والخلايا فرزها، في أيدينا، لا البقاء على قيد الحياة في الثقافة 1. لا تزال خطوط الخلايا أدوات مفيدة نظرا لحقيقة أنها هي خلية السكان متجانسة إلى حد كبير مما يفضي إلى التلاعب الجيني مثل الجينات إسكات. ونتيجة لذلك، فمن السهل للتحقيق في دور البروتينات التي لا يمكن استهداف دواء، عندما الفئران المعدلة وراثيا غير متوفرة. ومع ذلك، خطوط الخلايا ليست دائما نماذج صالحة من الخلايا الأولية. في حين أن هناك العديد من أوجه التشابه، والنتائج من الثقافات الأولية سلطت الضوء على مناسبة الاختلافات في مسارات إشارات تفعيلها من خلال بعض العناصر الغذائية في الخلايا L الأولية بالمقارنة مع خلايا GLUTag، على سبيل المثال (على سبيل المثال. peptones <الطبقة سوب = "XREF"> 11). الاهم من ذلك بالاشتراك مع المعدلة وراثيا الفئران مراسل فلوري، نموذج ثقافة الأساسي يتيح دراسة مفصلة للخلايا enteroendocrine الأساسي الفردية على مستوى الخلايا. وقد استخدمت خلايا L الموسومة Fluorescently داخل الثقافات الأولية من خلال مجموعتنا لتصحيح تحامل 1، 12 دراسة وحيدة الخلية الكالسيوم 11 و 13 و الأدينوزين الحلقي التصوير الأدينوزين-الحنق 14 دراسة، والتي أسفرت عن تقدم كبير في مجال enteroendocrine علم وظائف الأعضاء.
هو الأمثل لبروتوكول التالية لإجراء التجارب إفراز، وذلك باستخدام 24 لوحة جيدا أو لإعداد ما يصل إلى 16 أطباق التصوير، من الباب 10 سم من الأمعاء الدقيقة من ماوس الكبار واحد. بروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لدراسة خلايا القولون عن طريق زيادة مرات الهضم وشاركتركيز llagenase.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول العزلة والثقافة من الخلايا المعوية صغيرة الفئران مختلطة لتمكين دراسة إفراز الأمعاء الببتيد والتصوير خلية واحدة من خلايا enteroendocrine المسمى.
لزيادة احتمال الثقافات الأمعاء الصغيرة أن تكون ناجحة، من المهم أن البروتوكول وتنفيذه في أسرع وقت ممكن (من الناحية المثالية، ضمن 3 ساعات من حصاد الأنسجة) وأن الأنسجة يتم الاحتفاظ في وسط الجليد الباردة أو المخزن المؤقت السابق في عملية الهضم، للحد من موت الخلايا. وفي حين أنه ليس من الضروري، وخاصة للثقافات القولون، وشجعت بقوة إزالة الطبقة العضلية من الأمعاء الدقيقة. وقد بروتوكول ثقافة المعوية صغيرة موحدة قدر الإمكان. ومع ذلك، فمن المهم الإشارة إلى أن أي عملية الهضم هي متطابقة. هناك العديد من الخطوات خلال هذا البروتوكول حيث يمكن إدخال التغير على أساس يوما بعد يوم مثل درجة إزالة العضلات، وحجم رانه المفروم "قطع الأنسجة، وقوة الهز، وقوة من دفعة معينة من كولاجيناز الخ. ومن ثم فهي ذات أهمية قصوى لتفقد aliquots من كل من يختلف "هضم" تحت المجهر لتقييم التقدم المحرز في عملية الهضم وخياط والهز وعدد من وفقا لذلك "هضم". فمن المستحسن أن يهز بلطف أكثر لتبدأ، وإذا شظايا سرداب ليست واضحة من "هضم" 3 فصاعدا، لبدء تهتز بقوة أكبر.
من تجربتنا، وخلايا enteroendocrine لا تتكاثر في الثقافة، وعادة ما فقدت من الثقافات الأمعاء الصغيرة في غضون 4 أيام. ومع ذلك، وهذا يسمح متسع من الوقت لإجراء تجارب الأمعاء الببتيد إفراز (تقوم عادة على مدى 2 ساعة، 18-24 ساعة بعد الطلاء) لاختبار محفزات الفسيولوجية و / أو وكلاء الدوائية. التجارب التي تتطلب الحضانة بين عشية وضحاها قبل التجربة إفراز أيضا على سبيل المثال ممكنافي حالة ما قبل المعالجة مع السعال الديكي السم 15.
تقنية ثقافة الأولية المقدمة هنا هي طريقة راسخة، كما يتضح من حجم الانتاج البحوث أنتجت على مر السنين. وقد استخدم نموذج ثقافة الأساسي لدراسة إفراز مجموعة متنوعة من الببتيدات الأمعاء، بما في ذلك GLP-1 1، GIP 18 و 19 PYY، ردا على المواد الغذائية المتنوعة وغير الغذائية 14 و 20 المحفزات والمثبطات. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق نفس الأسلوب بنجاح إلى ثقافة الخلايا المعوية الإنسان 21. في كثير من الأحيان، وهو مزيج من طريقة زراعة الخلايا الأولية جنبا إلى جنب مع نموذج تجريبي إضافي على سبيل المثال. فيفو السابقين أو في الجسم الحي يمكن أن توفر معظم البصيرة 6. والجدير بالذكر وعلى النقيض من الأساليب الأخرى، وهذا الأسلوب له ايمتطبيقات portant خارج قياس الإفراج الأمعاء الببتيد. لقد أثبتنا أن الثقافات الأمعاء الصغيرة الأولية المستمدة من الفئران المعدلة وراثيا مراسل هي أدوات قوية لاستجواب مسارات الإشارات بين الخلايا إلى جانب أن القناة الهضمية إفراز الببتيد، وذلك باستخدام مثلا كا 2+ وأجهزة استشعار المخيم، GCaMP3 11 و 13 و 14 Epac2camps، على التوالي، فضلا عن تقنيات الكهربية 12.
كما هو الحال مع جميع النماذج في المختبر، والثقافات المعوية الأولية لديها بعض القيود المتأصلة بما في ذلك فقدان قطبية الخلايا الظهارية في الثقافة، فضلا عن فقدان إمدادات الدم والغدد العرقية. ومن الصعب تقدير الآثار المحتملة لهذه الظروف المصطنعة على وظيفة الخلية enteroendocrine. ومع ذلك، فإن البيانات التي تم الحصول عليها من ثقافات الأولية في كثير من الأحيان للترجمة في الجسم الحي في SETTIنانوغرام (مثل آثار الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة على GLP-1 إفراز 15).
ثقافات المعوية الأساسية هي تقنية متعددة مع العديد من التطبيقات المحتملة. وقدموا بالفعل رؤية الميكانيكية الهامة في تنظيم إفراز الأمعاء الببتيد.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أجريت GLP-1 المناعية فحوصات من قبل مختبر الكيمياء الحيوية الأساسية الفحص في مستشفى أدينبروكس.
، على مر السنين، تم دعم هذا العمل من قبل ويلكوم ترست (حاليا منح النشطة 106262 / Z / 14 / Z و106263 / Z / 14 / Z) ومجلس البحوث الطبية (MRC) (منح MRC_MC_UU_12012 / 3 و MRC_MC_UU_12012 / 5).
Materials
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 ml, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/ digestion |
| Centrifuge tubes, 50 ml, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | – | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | – | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium) |
References
- Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. Glucose sensing in L cells: A primary cell study. Cell Metab. 8, 532-539 (2008).
- Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. Gut chemosensing mechanisms. J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).
- Lovshin, J. A., Drucker, D. J. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).
- Brighton, C. A., et al. Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors. Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).
- Brubaker, P. L., Vranic, M. Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides. Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).
- Gerbe, F., et al. Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium. J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).
- Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells. Peptides. 77, 9-15 (2016).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).
- Emery, E. C., et al. Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1. Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).
- Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells. Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).
- Tolhurst, G., et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).
- Richards, P., et al. High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells. Peptides. 77, 21-27 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells. Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).
- Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans. Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).
- Moss, C. E., et al. Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents. Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).
- Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells. Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).
